人β-NGF重组质粒转染GFP转基因的小鼠骨髓基质干细胞的实验研究

发布时间：2017-11-27 13:31

  本文关键词：人β-NGF重组质粒转染GFP转基因的小鼠骨髓基质干细胞的实验研究

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【摘要】：目的：构建、并观察携带人-β-NGF（nervegrowthfactor,神经生长因子）重组质粒的骨髓基质干细胞（bonemarrowstromalstemcell,BMSC）的生物学特性，，为应用β-NGF修饰的BMSC进行耳蜗移植治疗老年聋的动物实验研究提供支持。方法：将含有重组质粒的阳性克隆大肠杆菌接种至37℃预温的LB培养基中，37℃震荡培养24小时进行细菌扩增，取扩增好的菌夜按质粒提取试剂盒说明提取重组质粒，提取成功后对其进行HindIII、XhoI双酶切鉴定，-20℃保存备用。复苏小鼠骨髓基质干细胞，流式细胞学鉴定其表面CD标记，然后将GFP转基因的小鼠骨髓基质干细胞分为四组：A组为脂质体2000包裹的重组质粒转染组；B组为脂质体转染组；C组为脂质体包裹的空质粒转染组；D组为含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液的阴性对照组。采用脂质体LipofectamineTM2000转染方法将含有人β-NGF神经生长因子的重组质粒转染至含有GFP基因的小鼠骨髓基质干细胞中，在倒置光学显微镜下对比各组细胞的数量及观察细胞突起的生长情况，收集各组细胞的上清液，分别利用酶联免疫吸附实验的方法检测各组细胞培养液中人-β-NGF基因的表达情况。结果：重组质粒pcDNA3-β-NGF经限制性内切酶HindIII和XhoI双酶切后，限制性内酶切片段长度与插入基因片段相符约725bp；将重组质粒按脂质体LipofectamineTM2000操作说明书进行转染，倒置光学显微镜下观察到各组细胞生长情况不同：实验组细胞生长状态良好，而脂质体转染组及空质粒组细胞生长状态较差，大量细胞出现胞膜不明显，细胞核碎裂，细胞形态混乱，空白对照组细胞无明显改变。于转染后48小时换液，收集各组细胞上清液，并用ELISA测定各组中是否有人-β-NGF蛋白的表达情况。NGF蛋白ELISA检测结果：A、重组质粒组为174.91±4.71pg/ml，B、空质粒组为5.94±0.91pg/ml，C、Lip2000组为5.71±0.50pg/ml，D、阴性对照组为5.79±0.80pg/ml，重组质粒组NGF蛋白表达量明显比其他各组NGF蛋白表达量高。结论：采用脂质体LipofectamineTM2000转染方法能成功的将NGF重组质粒转染至骨髓基质干细胞，经转染后携带NGF质粒的小鼠骨髓基质干细胞仍有增殖、分化能力，并且具有了NGF蛋白的表达能力，其表达的NGF蛋白能有效的保护转染过程中对细胞的损害，这些研究结果，可以为我们下一步应用β-NGF修饰的BMSC进行耳蜗移植治疗老年聋的动物实验研究提供基础。
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R764.436

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本文编号：1232057