锌指蛋白488在鼻咽癌中的表达及功能机制的研究

发布时间：2017-12-04 23:26

  本文关键词：锌指蛋白488在鼻咽癌中的表达及功能机制的研究

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【摘要】：第一部分 ZNF488对鼻咽癌细胞株HONE1生物学行为的影响目的：探讨ZNF488基因对鼻咽癌细胞HONE1生物学行为的影响。方法：构建携带空载体、人ZNF488基因的逆转录病毒质粒pMSCV和pMSCV-ZNF488,以磷酸钙法转染293FT细胞并收集病毒液,感染鼻咽癌细胞株HONEl,经嘌呤霉素筛选及Western-blotting鉴定,建立稳定表达ZNF488的HONEl-pMSCV-ZNF488和空载体HONE1-pMSCV的细胞株。应用噻唑盐(MTT)法、平板克隆形成实验检测ZNF488过表达对HONE1细胞生长增殖的影响,同时应用流式细胞术检测ZNF488对细胞周期增殖指数的影响。划痕实验及Transwell体外侵袭实验观察ZNF488对HONE1迁移侵袭能力的影响。Western-blotting检测上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关蛋白及抑癌基因PTEN的表达情况。结果：成功建立HONE1-pMSCV 和 HONEl-pMSCV-ZNF488稳定表达细胞株,MTT法及平板克隆形成实验结果显示,与空载体组HONE1-pMSCV细胞相比,HONE1-pMSCV-ZNF488细胞增殖及克隆形成能力均增强。流式细胞术显示过表达ZNF488细胞S期百分比较空载体组高,增殖指数增加。划痕实验、Transwell体外侵袭实验示ZNF488能够显著增加细胞的迁移、侵袭能力。Western-blotting检测发现上皮标志E-Cadhesion、a-Catenin表达降低,间质性标志Fibronectin、Vimentin表达升高,同时抑癌因子PTEN表达下降。结论：过表达ZNF488可通过诱导鼻咽癌细胞HONE1发生上皮间质转变及下调抑癌基因PTEN,促进细胞的增殖及迁移侵袭能力。第二部分ZNF488在鼻咽癌中的表达、功能及分子机制的研究目的：1、检测ZNF488在鼻咽癌中的表达,并明确其与预后的关系。2、探索ZNF488对鼻咽癌细胞株功能的影响,并进行分子机制的研究。方法：实时荧光定量PCR检测ZNF488在鼻咽癌组织、正常鼻咽组织、鼻咽癌细胞、正常鼻咽上皮细胞及永生化细胞中表达情况。免疫组织化学检测ZNF488在鼻咽癌组织中的表达情况。构建ZNF488过表达细胞株后,划痕试验及Transwell试验检测ZNF488对迁移和侵袭功能的影响。同时利用小分子RNA (SiRNA)技术基因敲除内源性ZNF488,进一步对功能进行验证。Western blotting在蛋白水平上检测上皮标志物及间质标志物,免疫荧光进一步验证上皮及间质标志物伴随ZNF488过表达之后的变化。平板克隆形成实验、软琼脂平板克隆形成实验及裸鼠体内成瘤实验在体外及体内水平检测ZNF488对成瘤能力的影响。基因芯片对比两对细胞株基因表达差异,并进行聚类分析。荧光素报告基因检测核转录因子TCF/LEF的转录活性。Western blotting检测通路蛋白的表达情况。统计方法如下：Student's T检验,X2检验,Kaplan-Meier生存分析,log-rank检验,并应用回归风险模型进行多因素分析。结果：ZNF488在鼻咽癌组织中表达水平高于正常鼻咽上皮组织,在鼻咽癌细胞株中普遍呈高表达,且在鼻咽癌细胞株5-8F和S18两株具有高转移特性的细胞株中明显呈高表达。免疫组织化学结果显示,ZNF488高表达区域主要位于癌巢前缘。生存分析研究表明,高表达ZNF488的患者,其总生存、无进展生存、无远处转移生存及无局部区域复发生存均明显低于低表达ZNF488的患者。功能实验表明,过表达ZNF488后,鼻咽癌细胞的迁移及侵袭能力均增加,而基因敲除ZNF488后,高转移细胞株的迁移及侵袭能力均减弱。过表达ZNF488后,鼻咽癌细胞的体内体外成瘤能力均增加。机制研究表明,ZNF488上调了β-Catenin、 p-GSK3β、Smad4、Snail和Slug表达,通过激活VVNT/β-Catenin及TGF-β/Smad4通路,两者共同作用下激活核转移因子TCF/LEF,从而诱导鼻咽癌细胞发生上皮间质转变。结论：ZNF488在鼻咽癌的发生发展中作为癌基因,通过激活WNT/β-Cate min及TGF-β/Smad4通路,激活核转移因子TCF/LEF,而诱导鼻咽癌细胞发生上皮间质转变,从而参与鼻咽癌的侵袭与转移过程。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.63

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