锁核酸核酶抑制EBV-LMP1基因表达及其对B95-8细胞生物学影响初步研究

发布时间：2017-12-19 14:36

  本文关键词：锁核酸核酶抑制EBV-LMP1基因表达及其对B95-8细胞生物学影响初步研究　出处：《重庆医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma，NPC）是我国南方常见的恶性肿瘤，每年新增患者人数居世界首位。目前认为鼻咽癌病因与EB病毒（Epstein-Barr Virus，EBV）密切相关。其中EBV编码的潜伏膜蛋白1（latent membrane protein1,LMP1）是唯一被证明的致瘤基因。针对EBV-LMP1基因靶向治疗成为人们广泛研究的热点。锁核酸核酶(Locked nucleic acid ribozyme， LNAzyme)，是一种在脱氧核酶（Deoxyribozyme，DNAzyme/DZ）基础上引入一个或几个锁核酸（Locked nucleic acid,LNA）单体而形成的特异性切割RNA的新型反义核苷酸。LNA是一种带双环状结构的寡核苷酸衍生物, LNA的引入使LNAzyme较相应的DZ切割效率明显提高，特别是与10～23型DNAzyme结合效率最高。 本研究选用课题组前期筛选的针对鼻咽癌EBV-LMP1的高效10～23型DZ167为基础，经LNA修饰设计合成LANzyme，以EBV-LMP1阳性的B95-8细胞为实验对象，比较DZ167和LNA167对LMP1表达的抑制作用，并观察其对B95-8细胞生物学的影响。初步探索锁核酸 目的：根据前期筛选的脱氧核酶DZ167为基础，设计合成锁核酸核酶LAN167，比较DZ167、LAN167对B95-8细胞靶基因EBV-LMP1的抑制效应。 方法：以B95-8为原型，EBV-LMP1基因为抑制靶点，设计合成脱氧核酶DZ167，对其5'端及3'端前2个结合臂分别进行硫代化修饰或引入2个LNA单体，并设计无催化活性中心的无序DNAzyme对照序列，所有序列5'端用FITC标记。经脂质体转染B95-8细胞，分为硫代修饰DZ167组（S-DZ167）、锁核酸核酶LNA167组、无序DZ167组。同时设立未转染空白对照组。转染后24h，荧光显微镜观察活细胞中荧光的分布情况，流式细胞仪测转染率。转染12h、24h、48h、72h及96h，采用Real-Time PCR评价S-DZ167、LNA167对LMP1稳定性及抑制时效关系。转染后48h采用Western blot方法检测LNA167、S-DZ167对EBV-LMP1蛋白表达的抑制情况。 结果：转染后24h，荧光显微镜观察各组均有绿色荧光表达，核酶主要分布于细胞浆、细胞膜。无序DZ167组、S-DZ167组、LNA167组转染效率分别为75.5%、76.7%及77.6%。 对LMP1稳定性及抑制时效关系评价结果示：与未转染组相比，LNA167组及S-DZ167组于转染后12h、24h、48h、72h对96h，LMP1均保持一定的抑制效应，抑制率分别为，23.73%，33.93%，44.89%，，27.45%，12.24%；45.76%，51.79%，71.43%，54.90%，22.45%。转染12h，LNA167及S-DZ167就表现出对LMP1的抑制作用，以48h最明显，之后逐渐下降；转染72h后，LNA167组与S-DZ167组抑制率相比，差异有显著性（P＜0.05）；转染至96h，仍然表现出对LMP1mRNA一定抑制效应，与未转染组相比，LNA167组差异有显著性（P＜0.05），而S-DZ167组差异无显著性（P＞0.05），两组相比虽然差异无显著性（P＞0.05），但LNA167组对LMP1mRNA抑制程度仍高于S-DZ167组。未转染组与无序DZ167相比差异均无显著性（P＞0.05）。 Western blot检测结果显示：与未转染组比较，无序DZ167组对EBV-LMP1蛋白表达抑制率为5.89%，差异无显著性（P＞0.05）；LNA167、S-DZ167对EBV-LMP1蛋白抑制率分别为49%、75.02%，LNA167与S-DZ167能不同程度地抑制EBV-LMP1蛋白，但LNA167抑制效应明显高于S-DZ167，差异有显著性（P＜0.05）。 结论：LNA167、S-DZ167对EBV-LMP1表达的抑制作用呈一定时效关系，48h抑制作用达高峰，以后逐渐下降，但LNA167抑制效应均高于S-DZ167；与S-DZ167相比，经LNA修饰的LNA167能高效抑制EBV-LMP1基因的表达； 目的：探讨锁核酸核酶靶向抑制LMP1后，对细胞毒性、增值活性、致瘤能力、凋亡的影响。 方法：将无序DZ167、S-DZ167及LNA167经脂质体分别转染EBV-LMP1阳性B95-8细胞、EBV-LMP1阴性的鼻咽癌CNE-2细胞，同时设立未转染的B95-8、CNE-2细胞为空白对照。转染24h、48h、72h后，采用CCK8法评价不同浓度S-DZ167、LNA167对CNE-2细胞毒性；转染24h、48h、72h后，CCK8检测各转染组对B95-8细胞增值活性影响；转染14d后，观察B95-8细胞在软琼脂中克隆形成情况；转染48h，流式细胞仪Annexing V-FITC/PI检测各转染组B95-8细胞的凋亡情况。 结果：细胞毒性结果显示：分别以2.0umol/L、5.0umol/L的LNA167及DZ167转染CNE-2细胞，与未转染组相比，不同浓度的抑制剂，在同一时间点对细胞增殖活性均差异无统计学意义（P＞0.05），转染前后细胞形态未见明显变化； CCK8细胞增值活性结果显示：转染24h，S-DZ167组及LNA167增值抑制率分别为23.52%、29.41%，与未转染组比较，差异有显著性（P＜0.05）。转染48h，各组抑制效率达最高，S-DZ167组及LNA167抑制率分别为，26.57%、62.74%，LNA167显著高于S-DZ167组，差异有显著性（P＜0.05）。转染至72h，LNA167组及S-DZ167组对B95-8的增值抑制效率逐渐降低，与未转染组比较，差异有显著性（P＜0.05），抑制效应LNA167组＞S-DZ167组。 软琼脂克隆形成结果，培养4～5d左右，未转组及无序DZ167组细胞开始聚拢形成克隆,形态较小。此时，LNA167组和S-DZ167组均未见克隆形成，增值能力及致瘤性明显减弱。培养至14d时， LNA167组、S-DZ167组、无序DZ167组及未转组形成的克隆数分别为15±1.67、32±2.31、62±5.13、58±2.36，克隆率分别为3%、6.4%、12.4%、11.6%，与未转组比较，LNA167组、S-DZ167组差异有显著习惯（P＜0.05）。无序DZ167组与未转组比较，差异均无显著性（P＞0.05）。 流式细胞仪检测凋亡率，转染48h后，无序DZ167组凋亡率为0.4%，与未转染对照组相比，差异无显著性（P＞0.05），而LNA167组、S-DZ167组凋亡率分别为24.16%、19.55%，与未转染对照组比较差异有显著性（P＜0.05）。凋亡抑制效应：LNA167组＞DZ167组＞无序DZ167组。 结论： LNA167、S-DZ167对细胞的正常增值活性无明显毒性，与S-DZ167相比，LNA167能明显抑制EBV-LMP1细胞的增值活性、使细胞致瘤能力明显下降，诱导细胞凋亡。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

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本文编号：1308360