木黄铜诱导人喉癌细胞系Hep-2凋亡及抑制其增殖的研究

发布时间：2017-12-27 09:24

本文关键词：木黄铜诱导人喉癌细胞系Hep-2凋亡及抑制其增殖的研究　出处：《河北医科大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：喉癌是全人类第11种常见的恶性肿瘤，主要来源喉部粘膜上皮组织。喉癌在病理组织学上，绝大部分为鳞状上皮细胞。治疗喉癌的传统方法主要是手术，放疗或辅助治疗。虽然手术切除病灶是治疗喉癌的直接手段，但术后要面对局部肿瘤高复发率的风险或是因发音和吞咽功能障碍所带来的较差的生活质量。寻求一种可以使肿瘤缩小，减小切除范围，降低复发率及提高患者生活质量和生存率的新化疗辅助药物显得日益重要。细胞凋亡也称细胞程序性死亡，其过程是由大量相关因子和信号通路共同参与，并严格调控的，是确保机体稳态，维持组织和器官形态正常必不可少的条件。异常的调亡途径常常会引起人类各种疾病，其中包括肿瘤。逃脱细胞凋亡不仅是肿瘤的常见特征也是肿瘤对化疗药物形成抵抗的形成原因。因此，那些可以通过阻断或抑制细胞增殖引起细胞凋亡的药物极有可能成为抗肿瘤药物。木黄酮（Genistein），化学名为4、5、7-三羟基异黄酮，是从广泛存在自然界的豆科植物中发现的一种具有天然生物活性的黄酮类化合物。摄入木黄酮后对机体除了产生以抗肿瘤为主的重要生物效应以外，还具有抑制骨质疏松形成、预防心血管疾病发生及减少绝经后不良反应等多种卫生保健作用。大量实验证实木黄酮在体内外对多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用。它的主要抗肿瘤机制为：1.调控细胞周期：经木黄酮处理后，大部分肿瘤细胞能够出现明显的G2/M期阻滞，可能与木黄酮可以调节细胞周期蛋白（cyclin B）、CDKIs （p21WAF1）在肿瘤细胞中的表达量有关。2.诱导细胞凋亡：用各种标志性检测细胞凋亡的技术方法，可以观察到经木黄酮干预后的肿瘤细胞出现了细胞凋亡， caspase-3的激活， Bcl-2、Bcl-xL表达量下降及Bax高表达等为其主要分子机制。3.调节细胞侵袭与转移：木黄酮可以从抑制FAK的磷酸化，选择性抑制MMPs，抑制TGF-β信号途径等多种途径，影响细胞粘附、迁移及侵袭。4.作为植物性雌激素：因为有着与17-β-雌二醇相似的化学结构，使其具有部分雌激素作用，可以与雌激素受体结合，近而影响性激素介导的肿瘤的生长（乳腺癌、前列腺癌等）。5.其他：影响VEGF的表达，抗血管形成；清除自由基，减少或防止活性氧对细胞的损伤，实现抗氧化作用。本实验旨在以人喉癌细胞系Hep-2为研究对象，通过倒置相差显微镜、荧光显微镜、CCK-8试剂盒、流式细胞术等方法和技术观察木黄酮对人类喉癌细胞系Hep-2抑制细胞周期和增殖及诱导细胞凋亡的作用，从而为木黄酮应用于临床中喉部肿瘤的治疗提供一些实验室数据。方法： 1在体外适宜条件下培养人喉癌细胞系Hep-2，并给予不同浓度的木黄酮进行干预。 2通过CCK-8试剂盒检测木黄酮对喉癌细胞增殖的抑制程度。 3分别在倒置相差显微镜及荧光显微镜下观察经木黄酮干预后细胞在细胞形态学以及生长情况等方面的变化。 4应用流式细胞术检测木黄酮对细胞周期各时相分布的影响和诱导细胞凋亡的情况。 5应用实时荧光定量PCR检测木黄酮引起人喉癌细胞系Hep-2中Bcl-2mRNA、Survivin mRNA表达量的改变。 6统计学处理：用统计软件SPSS13.0分析和统计实验数据结果。正态分布的计量资料用均数±标准差(x+s)表示。比较两样本均数选择t检验。用单因素方差分析进行多样本均数间的比较，若有显著性差异，接着用LSD法进行两两比较。所有比较结果，当Ｐ㩳0.05时则可认为具有统计学意义。结果：倒置相差显微镜下观察喉癌细胞形态学变化：空白对照组中的Hep-2细胞饱满，细胞形态轮廓清晰，呈梭形、多边形、上皮细胞样，良好的贴壁生长，在培养液中未见明显悬浮细胞。给予木黄酮干预的细胞胞浆浓缩，边缘不规则，可见部分细胞表面有出芽现象，一些溶解破碎细胞及脱落的悬浮细胞。CCK-8实验结果证明木黄酮可以明显抑制喉癌细胞的增殖，随着药物浓度的增加，其抑制率不断上升，，有显著的剂量依赖关系。流式细胞仪检测结果表明：木黄酮可以引起细胞G2期阻滞，当药物浓度增加时会出现S期阻滞，并伴随着G1期细胞比例的下降。喉癌细胞经12μg/ml木黄酮干预24小时后，其G2期及S期的细胞累积量明显增多，分别与对照组相比较，其差异均有统计学意义（Ｐ㩳0.05）。不仅如此，木黄酮还能诱导喉癌细胞出现凋亡，而且随着药物浓度增加和作用时间的累积，凋亡细胞数逐渐上升，呈明显的时间和剂量依赖关系。相同作用时间，不同浓度木黄酮作用于喉癌细胞后所诱导的凋亡率差异均有统计学意义（Ｐ㩳0.05），相同浓度的木黄酮分不同时间长度作用喉癌细胞后，其出现的凋亡率差异有统计学意义（Ｐ㩳0.05）。应用实时荧光定量PCR可以检测到：Bcl-2mRNA、Survivin mRNA在经过木黄酮处理后的喉癌细胞中表达量下降，分别与对照组相比较，差异具有统计学意义（Ｐ㩳0.05）。结论： 1木黄酮能够对喉癌细胞系Hep-2的增殖具有抑制作用，而且抑制作用呈剂量依赖效应。 2木黄酮可以使喉癌细胞发生细胞周期阻滞，主要阻滞在G2期；随着药物浓度，处于S期的细胞百分比例也有明显上升。阻滞细胞周期可能是木黄酮诱导喉癌细胞系Hep-2凋亡的一种作用机制。 3木黄酮能诱导喉癌细胞发生凋亡呈时间和剂量依赖性，当12μg/ml木黄酮作用喉癌细胞24小时后细胞就出现较多凋亡，随剂量和时间增加，凋亡率不断增高。 4木黄酮降低了喉癌细胞Bcl-2、Survivin的表达量。
[Abstract]:Objective: laryngeal carcinoma is the eleventh common malignant tumor of all human beings, mainly from the mucous epithelium of the larynx. Most of the carcinoma of the larynx is squamous cell in histopathology. The traditional methods for the treatment of larynx cancer are surgery, radiotherapy or adjuvant therapy. Although surgical resection is a direct way to treat laryngeal cancer, postoperative risk of local recurrence or poor quality of life due to dysphagia and dysphagia is the key. It is increasingly important to find a new adjuvant chemotherapy drug that can reduce the tumor size, reduce the extent of resection, reduce the recurrence rate and improve the quality of life and survival rate of patients. Apoptosis, also known as programmed cell death, is involved in the process and regulated strictly by a large number of related factors and signaling pathways. It is essential to ensure homeostasis and maintain normal morphology of tissues and organs. Abnormal apoptosis often causes a variety of human diseases, including tumors. Escape from apoptosis is not only a common feature of cancer, but also the cause of the formation of tumor resistance to chemotherapeutic drugs. Therefore, drugs that can cause cell apoptosis by blocking or inhibiting cell proliferation are extremely likely to become antitumor drugs. Genistein, the chemical name is 4, 5, 7- three hydroxy isoflavones, is a natural activity of Flavonoids from widely occurring natural legumes. After taking flavonoid, the body not only produces important biological effects, but also has many health care functions, such as inhibiting osteoporosis, preventing cardiovascular diseases and reducing postmenopausal adverse reactions. A large number of solid wood flavonoids have obvious inhibitory effects on a variety of tumor cells in vivo and in vivo. The main anti-tumor mechanism of it as follows: 1.: regulation of cell cycle by genistein treatment, most tumor cells can appear obvious G2/M arrest, and Genistein can regulate the cell cycle protein (cyclin B), CDKIs (p21WAF1) is expressed in tumor cells. 2., induce cell apoptosis: we can observe the apoptosis of tumor cells after Huang Tonggan's prognosis, the activation of Caspase-3, the decrease of Bcl-2 and Bcl-xL expression and the high expression of Bax. 3., regulate cell invasion and metastasis: Genistein can inhibit cell adhesion, migration and invasion by inhibiting FAK phosphorylation, selectively inhibiting MMPs and inhibiting TGF- beta signaling pathway. 4., as a phytoestrogen, because it has a similar chemical structure with 17- beta estradiol, it has partial estrogen effect, which can bind to estrogen receptor, and influence the growth of hormone mediated tumor (breast cancer, prostate cancer and so on). 5. other: affecting the expression of VEGF, anti angiogenesis, scavenging free radicals, reducing or preventing the damage of reactive oxygen species to cells, and achieving antioxidant effects. This experiment aimed at human laryngeal cancer cell line Hep-2 as the research object, through the inverted phase contrast microscope, fluorescence microscope, CCK-8 kit and flow cytometry methods and techniques of observation of genistein on human laryngeal carcinoma cell line Hep-2 cell cycle and inhibit proliferation and induce apoptosis in, so as to provide some laboratory data for treatment of genistein applied to the laryngeal tumor in clinic.
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.65

【参考文献】