抗TNF-α和IL-1βIgY抗体治疗豚鼠过敏性鼻炎的实验研究

发布时间：2018-01-09 00:18

  本文关键词：抗TNF-α和IL-1βIgY抗体治疗豚鼠过敏性鼻炎的实验研究　出处：《南昌大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的： 探讨抗TNF-α及IL-1β IgY滴鼻治疗过敏性鼻炎及改善肺组织炎症的作用及其机制。 方法： 1、IgY抗体制备 2、应用卵清蛋白腹腔注射致敏、滴鼻攻击方法建立豚鼠过敏性鼻炎模型。 3、采用卵清蛋白皮内注射方法鉴定豚鼠过敏性鼻炎模型。 4、豚鼠随机分为正常对照组（C组），过敏性鼻炎模型组（M组），非特异性IgY治疗组（Z1组），0.1%抗TNF-α IgY治疗组（Z2组），0.1%抗IL-1βIgY治疗组（Z3组），0.1%抗TNF-α和IL-1β IgY治疗组（Z4组），丙酸氟替卡松治疗组（Z5组）。每组治疗结束后在2h、4h、8h等三个时间点观察结果。 5、C组（生理盐水滴鼻攻击）、M组、Z1组、Z2组、Z3组、Z4组、Z5组每次OVA滴鼻攻击和治疗时滴入IgY或生理盐水后再滴入OVA滴鼻攻击后30min内通过肉眼观察对豚鼠的症状（打喷嚏、抓鼻、流涕量）表现，并进行记录和评分。 6、各组实验结束日末次治疗和OVA激发后在2h、4h、8h腹腔注射10%水合氯醛麻醉豚鼠，使用PBS缓冲液滴注豚鼠鼻腔进行鼻灌洗，并抽取鼻灌洗液（NLF），离心，取上清和沉淀细胞。 7、各组实验结束日末次治疗和OVA激发后在2h、4h、8h腹腔注射10%水合氯醛麻醉豚鼠，采用心脏穿刺法抽取血液，抗凝，血涂片，离心取血浆。 8、各组实验结束日末次治疗和OVA激发后在2h、4h、8h处死豚鼠，对右肺采用PBS缓冲液进行支气管肺泡灌洗，抽取支气管肺泡灌洗液（BALF）离心取沉淀细胞。 9、各组实验结束日末次治疗和OVA激发后在2h、4h、8h处死豚鼠，分离鼻黏膜组织及左肺、4%多聚甲醛固定组织、石蜡包埋固定的组织、组织切片等，进行病理检查。 10、采用双抗夹心酶联免疫法（ELISA）测定各组血浆、鼻灌洗液(NLF)中TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-9、IL-13、IL-18、IL-22、IL-33、TGF-β等炎症细胞因子和Th2细胞因子，以及OVA特异性IgE含量。 11、采用Wright's染色法对血液、鼻灌洗液（NLF）、支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞涂片进行染色，计数嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞数量。 12、采用HE染色法对鼻黏膜组织和肺组织切片进行染色，观察组织病理学变化以及组织嗜酸性粒细胞浸润，并计数组织嗜酸性粒细胞数量。 13、采用免疫组织化学染色法对鼻黏膜组织和肺组织切片进行TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-33染色，观察组织细胞TNF-α、IL-1β、IL-5、IL-33的表达量的变化。 14、采用SPSS19.0统计学软件包对数据进行统计分析。 结果： 1、经卵清蛋白腹腔注射致敏、滴鼻攻击建立Hartley豚鼠过敏性鼻炎模型的成功率为96.63%（172只/178只），豚鼠死亡率69.85%（183只/262只）。 2、与M组比较，Z2组、Z3组、Z4组、Z5豚鼠OVA激发30min内其过敏症状明显减轻，抓鼻次数、打喷嚏数、以及流涕量逐渐减少（P0.05）；而C组豚鼠滴鼻生理盐水时偶见轻度抓鼻，未见打喷嚏和流鼻涕症状。 3、鼻粘膜：正常对照组（C组）鼻粘膜固有层偶见淋巴细胞浸润；0.1%抗TNF-α和IL-1β IgY治疗组（Z4组）和丙酸氟替卡松治疗组（Z5组）在嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润，粘膜层水肿，粘膜上皮细胞完整性等方面明显轻于模型组（M组）和非特异性IgY治疗组（Z1组），同时也轻于0.1%抗TNF-α IgY治疗组（Z2组）和0.1%抗IL-1β IgY治疗组（Z3组），尤其是在8h。 肺组织：正常对照组（C组）粘膜下层偶见淋巴细胞浸润；0.1%抗TNF-α和IL-1β IgY治疗组（Z4组）和丙酸氟替卡松治疗组（Z5组）在嗜酸性粒细胞和中性粒细胞、淋巴细胞浸润，支气管粘膜细胞脱落，肺间质水肿，肺泡管结构受损，肺间隔增厚和断裂，管壁平滑肌增厚等方面明显轻于模型组（M组）和非特异性IgY治疗组（Z1组），同时也轻于0.1%抗TNF-α IgY治疗组（Z2组）和0.1%抗IL-1β IgY治疗组（Z3组），尤其是在8h。 4、在2h、4h、8h时间点豚鼠鼻粘膜和肺组织中，嗜酸性粒细胞百分率在C组Z5Z4Z3Z2Z1和M组等依次减少；其中Z4和Z5组显著低于M和Z1组（P0.05）。 5、在鼻粘膜IL-1β、TNF-α、IL-5和IL-33的表达主要位于鼻粘膜上皮细胞和固有层的腺体细胞内，而在肺组织IL-1β、TNF-α、IL-5和IL-33的表达主要位于肺泡和肺泡隔腺体细胞和支气管粘膜上皮细胞的细胞内，其中IL-1β、IL-33在Z4组和Z5组表达量较M组、Z1组、Z2组和Z3组明显降低，而M组与Z1组、以及Z4组与Z5组的表达量无明显差异。 6、在外周血中2h的Z2、Z3、Z5组，8h的Z4组，嗜酸性粒细胞显著低于M组（P0.05）。 在鼻灌洗液中2h、4h、8h的Z2、Z3、Z4、Z5组嗜酸性粒细胞显著低于M组和Z1组（P0.05）；在2h的Z5组，在4h的Z3、Z4、Z5组，在8h的Z3、Z5组，嗜中性粒细胞显著低于M组（P0.05）；在2h的Z4和Z5组，4h的Z4组，8h的Z3和Z5组，淋巴细胞显著低于M组（P0.05）。 在支气管肺灌洗液中2h的Z2、Z3、Z4、Z5组，4h和8h的Z3、Z4、Z5组嗜酸性粒细胞显著低于M组（P0.05）；在2h的Z2、Z3、Z4组，Z5组，，8h的Z4组，嗜中性粒细胞显著低于M组（P0.05）；在2h的Z1、Z3、Z4、Z5组，4h的Z3和Z5组，8h的Z5组，淋巴细胞显著低于M组（P0.05）。 7、在鼻灌洗液中2h时，Z2、Z3、Z4、Z5组IL-1β、TNF-α、IL-5、IL-9、IL-33等炎症细胞因子和OVA特异性IgE抗体的含量显著低于模型组（M组）和非特异性IgY治疗组（Z1组）；IL-13的含量在Z3、Z4、Z5组显著低于M组、Z1和Z2组； IL-18、TGF-β和IL-22的含量在Z2、Z3、Z4、Z5组显著低于M组（P0.05）。4h时，Z2、Z3、Z4、Z5组IL-1β、IL-5、IL-9、IL-33等炎症细胞因子和OVA特异性IgE抗体的含量显著低于模型组（M组）和非特异性IgY治疗组（Z1组）；IL-13的含量在Z3、Z4、Z5组显著低于M组和Z2组；TNF-α的含量在Z2、Z3、Z4、Z5组显著低于M组；TGF-β的含量在Z3、Z4、Z5组显著低于M组；IL-22的含量在Z4组和Z5组显著低于M组（P0.05）。8h时，Z2、Z3、Z4、Z5组IL-1β、IL-5、IL-9、TNF-α、IL-33的含量，Z3、Z4、Z5组IL-13和IL-22的含量，Z2、Z4、Z5组TGF-β的含量，Z4组OVA特异性IgE抗体的含量显著低于模型组（M组）（P0.05）；Z2、Z3、Z4、Z5组IgE、IL-1β、IL-9、IL-22、TGF-β的含量，Z3、Z4、Z5组IL-5、IL-33、TNF-α的含量，Z5组IL-13的含量显著低于非特异性IgY治疗组（Z1组）（P0.05）。 8、在血浆中2h时，Z2、Z3、Z4、Z5组TNF-α、IL-13、TGF-β、IL-33等炎症细胞因子和OVA特异性IgE抗体的含量显著低于模型组（M组）和非特异性IgY治疗组（Z1组）（P0.05）；Z2、Z3、Z4、Z5组IL-5、IL-9的含量，Z1组IL-9、IL-13、TNF-α的含量，Z3、Z4、Z5组IL-18的含量，以及Z4和Z5组IL-1β的含量显著低于模型组（M组）（P0.05）；Z3、Z4、Z5组IL-5，Z4组IL-9，Z3和Z4组IL-18，以及Z4和Z5组IL-1β、IL-22等炎症细胞因子的含量显著低于非特异性IgY治疗组（Z1组）（P0.05）。4h时，Z2、Z3、Z4、Z5组IL-5、IL-18、TGF-β、IL-22、IL-33等炎症细胞因子的含量显著低于模型组（M组）和非特异性IgY治疗组（Z1组）（P0.05）；Z1、Z2、Z3、Z4、Z5组的IL-13，Z2、Z3、Z4、Z5组的OVA特异性IgE，Z3、Z4、Z5组的IL-1β、IL-9，Z4组的TNF-α等炎症细胞因子含量显著低于模型组（M组）（P0.05）；Z2、Z4、Z5组的OVA特异性IgE，Z3、Z4、Z5组的IL-9，Z3和Z5组的IL-13，Z4和Z5组的IL-1β，Z4组的TNF-α等炎症细胞因子含量显著低于非特异性IgY治疗组（Z1组）（P0.05）。8h时， Z2、Z3、Z4、Z5组IL-5、TGF-β、IL-33等炎症细胞因子的含量显著低于模型组（M组）和非特异性IgY治疗组（Z1组）（P0.05）；Z5组的OVA特异性IgE抗体，Z4和Z5组的IL-1β、IL-9，Z1、Z2、Z3、Z4组的IL-13，Z4组的IL-18，Z2和Z5组的TNF-α，以及Z1、Z2、Z3、Z4、Z5组的IL-22等炎症细胞因子含量显著低于模型组（M组）（P0.05）；Z5组的OVA特异性IgE抗体，Z4和Z5组的IL-9， Z2、Z3、Z4、Z5组的TNF-α、IL-18，以及Z2组的IL-22等炎症细胞因子含量显著低于非特异性IgY治疗组（Z1组）（P0.05）。 9、在血浆中炎症细胞因子TNF-α与IL-1β （r=0.623，P0.01）、IL-5（r=0.676，P0.01）、IgE（r=0.703，P0.01）、IL-9（r=0.634，P0.01）、IL-13（r=0.541，P0.01）、IL-18（r=0.703，P0.01）、TGF-β（r=0.779，P0.01）、IL-22（r=0.324，P0.01）、IL-33（r=0.723，P0.01），以及IL-1β与IL-5（r=0.677，P0.01）、IgE（r=0.723，P0.01）、IL-9（r=0.745，P0.01）、IL-13（r=0.576，P0.01）、IL-18（r=0.558，P0.01）、TGF-β（r=0.728，P0.01）、IL-22（r=0.515，P0.01）、IL-33（r=0.750，P0.01）等炎症细胞因子的含量呈正相关。 在鼻灌洗液中炎症细胞因子TNF-α与IL-1β（r=0.761，P0.01）、IL-5（r=0.619，P0.01）、IgE（r=0.657，P0.01）、IL-9（r=0.736，P0.01）、IL-13（r=0.549，P0.01）、TGF-β（r=0.625，P0.01）、IL-22（r=0.704，P0.01）、IL-33（r=0.691，P0.01），以及IL-1β与TNF-α（r=0.761，P0.01）、IL-5（r=0.754，P0.01）、IgE（r=0.821，P0.01）、IL-9（r=0.877，P0.01）、IL-13（r=0.583，P0.01）、IL-18（r=0.402，P0.01）、TGF-β（r=0.721，P0.01）、IL-22（r=0.719，P0.01）、IL-33（r=0.779，P0.01）等炎症细胞因子的含量呈正相关。 结论： 1、采用卵清蛋白（OVA）和氢氧化铝凝胶腹腔注射基础免疫，及OVA滴鼻加强免疫（攻击或激发）豚鼠成功地建立了稳定的过敏性鼻炎豚鼠模型。 2、抗TNF-α和IL-1β IgY抗体滴鼻局部治疗过敏性鼻炎模型豚鼠能够有效地抑制由OVA诱导的过敏性鼻炎豚鼠鼻粘膜和肺组织过敏性炎症病理反应的发展，并减轻过敏性炎症病理反应程度。 3、抗TNF-α和IL-1β IgY抗体治疗豚鼠过敏性鼻炎的作用机制可能是通过抑制嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和淋巴细胞等炎症细胞的增加和浸润，减少IL-1β、TNF-α、TGF-β1、IL-5、IL-9、IL-13、IL-22、IL-33等原炎症因子和Th2细胞因子，以及OVA特异性IgE抗体的水平而发挥作用。 4、卵清蛋白（OVA）诱导的过敏性鼻炎模型豚鼠并发过敏性哮喘的症状和过敏性炎症病理改变，充分证明上下呼吸道过敏性炎症的同步性、一致性，同时也证明治疗的一致性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R765.21


本文编号：1399265