探讨K1f4在鼻咽癌增殖、EMT和侵袭转移中的调控作用

发布时间：2018-01-12 06:19

  本文关键词：探讨K1f4在鼻咽癌增殖、EMT和侵袭转移中的调控作用　出处：《南方医科大学》2013年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是我国南方和东南亚常见的恶性肿瘤之一,是指发生在鼻咽粘膜的恶性肿瘤。其发病与环境、饮食、遗传以及EBV(Epstein Barr Virus)感染等因素有关,发病年龄大多为中年人,流行病学研究发现,鼻咽癌发病有地域、民族和家族聚集现象。目前NPC的治疗方法有放疗和化疗,以放射治疗为主,早期治愈率较高,但因其恶性程度高,早期既有淋巴结转移,因此就诊时往往已达中晚期,此时其治愈率却不理想。而且目前,对于NPC的具体发病机制还不是十分清楚,因此对于进一步了解NPC的发生发展以及与之相关的治疗手段值得我们深入研究。 Klf4(Kruppel-like factor4)属于Klf家族,为一种真核生物中具有锌指样结构的蛋白转录因子。Klf4首先由Shields JM等于1996年被描述,他们从小鼠的NIH3T3细胞cDNA文库中分离得到该基因,因其主要在消化道表达,故又被称之为胃肠富集Klf(gut-enriched Kruppel-like factor, GKlf)。Klf4蛋白含有多个功能区域,包括N末端的富含酸性氨基酸的转录激活区,能够参与蛋白-蛋白之间的相互作用；以及c-端能与DNA结合区域结合的锌指结构区域(易与CACCC序列元件和(或)富含GC序列的靶基因调节序列结合),另外还有临近N-端锌指结构区域的转录抑制区。Klf4主要在皮肤、口腔、胃肠道上皮、血管内皮等处表达丰富。 Klf4在体内多个方面发挥着重要的作用,参与正常组织细胞的增殖、分化以及凋亡等多种生物学行为,并能够维持干细胞的自我更新。Klf4通过与不同的靶基因结合,可以激活或抑制转录。在结肠上皮中,Klf4可以通过抑制细胞增殖和促进其分化来维持结肠上皮的体内平衡,另外,Klf4还是皮肤上皮分化的一个重要分子；研究发现,在血管损伤后,Klf4可以在平滑肌细胞中迅速表达上调。 除此之外,在肿瘤组织中,Klf4可以通过与不同靶基因的作用,发挥癌基因或抑癌基因的作用,从而多角度的参与肿瘤的发生发展。在结肠癌中,因Klf4的甲基化和杂合性的丢失,证明Klf4在结肠癌为低表达,并且Klf4通过与APC基因结合来抑制Wnt通路从而进一步抑制结肠癌的发生；另外,更多的证据表明,Klf4同样可以抑制胃癌的发生。研究发现,Klf4在食管癌、膀胱癌和肺癌的组织中均表达降低,起抑癌基因的作用,而在乳腺癌组织中,其表达升高,发挥癌基因的作用。研究证实,Klf4表达升高为喉鳞癌的一个早期事件。研究表明,无论Klf4作为癌基因或抑癌基因,可能与不同的细胞环境、其他基因的表达模式和单个细胞染色质环境有关。 迄今,Klf4在NPC发病中所发挥的作用尚不清楚,那么其在NPC中的表达情况是怎样的,又是如何参与NPC的发生发展呢?这些都值得我们进一步探讨。 鉴于Klf4目前的研究现状,我们检测了NPC细胞及组织中Klf4的表达谱,基于携带Klf4的慢病毒载体建立稳定过表达Klf4的NPC细胞株,并通过检测NPC细胞株的生物学行为及EMT相关基因的变化,来阐明Klf4在NPC发生发展中所发挥的功能,同时我们还合成了下调Klf4表达的siRNA,反面验证Klf4在NPC中的作用。为此我们进行了如下研究。 方法： 第一章NPC细胞株和组织标本中Klf4的表达谱 1.通过qRT-PCR检测CNE1、CNE2、C666-1、 HNE1、5-8F、6-1OB、SUNE1和HONE18种NPC细胞株中Klf4表达谱(以NP69作为对照)。 2.收集NPC组织标本21例和慢性鼻咽炎症组织标本6例,应用qRT-PCR检测Klf4的表达谱,结果分析运用2-ΔΔCt方法进行比较。 第二章Klf4对NPC细胞增殖的影响 1.建立稳定过表达Klf4的NPC细胞株 利用慢病毒表达载体pLenti-Klf4生产携带Klf4的慢病毒,收集病毒上清分别感染NPC细胞株5-8F、HONE1和SUNE1,48-72h后于倒置荧光显微镜下检测EGFP表达以观察感染情况,若感染效率低于90%,应用流式细胞仪分选EGFP+细胞,大量扩增细胞并保种；提取细胞RNA及蛋白,通过qRT-PCR、 Western blot检测稳定细胞株中Klf4的表达水平。 2.Klf4过表达对NPC细胞体外增殖能力的影响 通过CCK8实验、平板克隆和细胞周期检测细胞增殖能力改变。 3.下调Klf4表达对NPC细胞体外增殖能力的影响 3.1.化学合成两条Klf4siRNA,瞬时转染NPC细胞(5-8F),48h收集细胞并提取RNA及蛋白,通过qRT-PCR、Western blot检测两条Klf4siRNA的抑制效果,选取抑制效率高的一条进行后续实验； 3.2.Klf4siRNA瞬时转染5-8F. HONE1,待细胞生长状态良好时,通过CCK8实验检测细胞增殖能力。 4.Klf4过表达对NPC细胞体内增殖能力的影响 4.1培养扩增5-8F-Klf4、5-8F-con细胞； 4.2选取生长状态良好的细胞接种于裸鼠皮下,建立NPC异位移植瘤模型,进一步研究Klf4过表达对鼻咽癌细胞体内成瘤能力的影响。待肿瘤长径为0.5cm时隔天测量瘤径,最后计算肿瘤体积：肿瘤组织取材、固定、染色、并运用免疫组织化学方法检测肿瘤组织中Ki-67. BrdU和p21表达,最后统计分析。 第三章Klf4对NPC细胞EMT和迁移能力的影响 1.培养过表达Klf4的细胞株,Transwell小室检测细胞迁移能力改变,qRT-PCR、Western blot检测E-cadherin、a-catenin、Fibronectin、N-caherin及vimentin等EMT相关基因的变化。 2. Klf4siRNA瞬时转染NPC细胞,Western blot检测EMT相关基因的变化,Transwell小室实验评价下调Klf4后细胞体外迁移能力的变化。 结果： 第一章Klf4在NPC细胞株和组织标本中均低表达 (1) qRT-PCR检测结果显示：与NP69相比,Klf4在8株NPC细胞中的表达下调(F=34.891,p0.001)。 (2) qRT-PCR检测NPC组织标本中Klf4表达,结果显示：Klf4在NPC组织中的表达低于鼻咽慢性炎症组织(t=-2.599,p=0.015)。 第二章Klf4抑制NPC细胞的增殖 1.成功构建稳定过表达Klf4的NPC细胞株 利用携带Klf4的慢病毒感染NPC细胞株,48-72h后于倒置荧光显微镜下检测有EGFP表达确认感染成功,随后提取细胞RNA及蛋白,qRT-PCR检测证实携带有Klf4转基因的NPC细胞株中Klf4表达升高(p＜0.01)(表2-1,图2-3)；Werstern blot结果显示,与对照组相比,Klf4在HONE1、5-8F两株细胞中表达均升高,但SUNE1细胞中Klf4的表达升高不明显,结果如图(2-3),上述结果提示已成功构建稳定过表达Klf4的NPC细胞(5-8F-Klf4、HONE1-Klf4)。 2.Klf4过表达后NPC细胞体外增殖能力减弱 稳定过表达Klf4细胞株构建完成后,通过细胞周期、平板克隆、CCK8检测细胞增殖能力改变。CCK8结果：过表达Klf4使HONE1、5-8F细胞的增殖速率均减慢(p＜0.001,图2-4)；平板克隆结果：Klf4过表达使HONE1、5-8F细胞的克隆形成能力降低,其克隆形成率分别降低了67%(p＜0.05)和32.17%(p＜0.01)；细胞周期分布显示：与对照组相比,Klf4过表达使S期细胞比例减少15.43%(p＜0.05),G1期细胞比例显著增高(p＜0.01),该结果表明Klf4过表达可诱导细胞周期S期阻滞(图2-6)。 3.下调Klf4表达后NPC细胞体外增殖能力增强 3.1将化学合成的两条Klf4siRNA分别转染至NPC细胞中,48h后收集细胞RNA和蛋白,通过qRT-PCR、Western blot检测两条Klf4siRNA的抑制效果,结果显示：5-8F转染Klf4siRNA#1后,与对照组相比,Klf4的抑制效率为93.71%(p＜0.001,图2-7),而转染Klf4siRNA#2后Klf4的干扰效率为87.3%(p＜0.001,图2-7),提示Klf4siRNA#1的抑制效率较高,故选择Klf4siRNA#1做后续实验。 3.2瞬时转染Klf4siRNA细胞培养48h后,通过CCK8实验检测下调Klf4表达后细胞的体外增殖能力,结果显示：下调Klf4后,细胞增殖能力增强(p＜0.01,图2-8)。 4.过表达Klf4可抑制NPC细胞体内增殖能力 裸鼠皮下成瘤实验结果显示：接种5-8F-Klf4细胞的6只裸鼠中,有5只小鼠成瘤,而对照组细胞6只小鼠均成瘤,且5-8F-Klf4细胞所成肿瘤体积及瘤重明显小于对照组(p0.05),此外,免疫组化结果发现,Klf4过表达组BrdU和Ki-67阳性的细胞的显著降低(p＜0.01),而p21阳性的细胞则显著升高p＜0.01)。 第三章Klf4对NPC细胞EMT和迁移能力的影响 1.Klf4对NPC细胞EMT的影响 通过qRT-PCR、Werstern blot检测过表达Klf4细胞株中EMT相关基因的变化。qRT-PCR结果显示：在5-8F、HONE1细胞中过表达Klf4后,与对照组比较,两株细胞中E-cadherin均表达上调(p＜0.05,图3-1),而在HONE1、5-8F中间质细胞标志物N-cadherin表达水平下降(p＜0.05,图3-1),HONE1细胞中间质细胞标志物Fibronectin表达下降(p＜0.05)。 Werstern blot实验结果发现,与对照组相比,在5-8F、HONE1细胞中过表达Klf4后,E-cadherin表达上调,而N-cadherin和vimentin表达水平下降(图3-1)。 下调NPC细胞株中内源性Klf4表达水平后,Werstern blot检测细胞中EMT相关基因的变化。结果显示,与对照组细胞相比(HONE1-Klf4、5-8F-Klf4), E-cadherin表达下调,而N-cadherin和vimentin表达水平升高(图3-2)。 2.Klf4对NPC细胞迁移能力的影响 Transwell实验结果显示：在5-8F、HONE1细胞中,过表达Klf4后,与空载细胞相比,细胞穿膜数量明显减少(p＜0.01,表3-1和图3-3)。下调Klf4表达后,细胞穿膜数量比对照组增加(p＜0.05,图3-4) 结论：Klf4抑制NPC细胞增殖、诱导MET；并抑制NPC细胞体外迁移。
[Abstract]:Nasopharyngeal carcinoma (nasopharyngeal carcinoma NPC) is one of South China and the Southeast Asia common malignant tumors that occur in nasopharyngeal mucosa malignant tumors. The incidence of genetic and environment, diet, and EBV (Epstein Barr Virus) infection and other factors, the age of onset mostly middle-aged, epidemiological studies have found that the incidence of nasopharyngeal carcinoma regional, ethnic and familial aggregation. Current treatment of NPC with radiotherapy and chemotherapy, radiation therapy, early cure rate is high, but because of the high degree of malignancy, early lymph node metastasis, the treatment often has reached advanced stage, the cure rate is not ideal. But at present, for NPC the specific pathogenesis is still not very clear, so for the further understanding of the occurrence and development of NPC and treatment related worthy of our in-depth study.
Klf4 (Kruppel-like factor4) belongs to the Klf family, is a kind of eukaryotes with zinc finger structure protein transcription factor.Klf4 by Shields JM in 1996 was the first to describe, they isolated the gene from the cDNA Library of NIH3T3 cells in mice, mainly because of its expression in the digestive tract, so it is also called gastrointestinal the enrichment of Klf (gut-enriched Kruppel-like factor, GKlf).Klf4 protein contains a plurality of functional areas, rich in acidic amino acids including N transcription at the end of the active region, can be involved in protein-protein interaction; and the c- terminal can be combined with the DNA region binding zinc finger domain (with CACCC sequence elements and (or) target gene regulatory sequences with GC rich sequences), in addition to N- near the end of the zinc finger transcription inhibition zone of.Klf4 structure in the region is mainly in the skin, oral cavity, gastrointestinal epithelium, the expression of rich vascular endothelial and so on.
Klf4 plays an important role in many aspects of the body, in normal tissue cell proliferation, differentiation, apoptosis and other biological behavior, and be able to maintain stem cell self-renewal by.Klf4 and target genes of different combination, can activate or inhibit transcription in the colon in the skin, Klf4 can inhibit and promote their differentiation cell proliferation to maintain homeostasis, colonic epithelium in Klf4 or skin epithelial differentiation is an important molecule; found in vascular injury, Klf4 can rapidly up-regulated expression in smooth muscle cells.
In addition, in tumor tissues, Klf4 can be obtained with different target genes play a role in oncogenes or tumor suppressor genes, which participate in the occurrence and development of tumor multi angle. In colon cancer, due to Klf4 methylation and loss of heterozygosity, that low expression of Klf4 in colon cancer and, combined with the APC gene to inhibit the Wnt pathway to inhibit colon cancer by Klf4; in addition, more evidence that Klf4 can also inhibit the occurrence of gastric cancer. The study found that Klf4 in esophageal cancer, bladder cancer and lung cancer tissues were lower expression of tumor suppressor gene plays a role in breast cancer tissues, its expression increased, play the role of oncogenes. The study confirmed that the increased expression of Klf4 is an early event in laryngeal squamous cell carcinoma. The results show that both Klf4 as oncogenes or tumor suppressor genes, with different cell environment, gene expression The model is related to the chromatin environment of a single cell.
So far, the role of Klf4 in the pathogenesis of NPC is not clear. What is its expression in NPC and how to participate in the occurrence and development of NPC? All these are worthy of further discussion.
In view of the present situation of Klf4, we detected the expression of Klf4 NPC cells and tissue spectrum, lentivirus vector based on Klf4 to establish a stable NPC expressing Klf4 cell line, and by detecting the changes of NPC cell lines and biological behavior of EMT related genes, to elucidate the Klf4 in the NPC play in the development of at the same time, we also synthesized the siRNA expression of Klf4, negative verification of Klf4 in NPC. We carried out the following research.
Method锛，

本文编号：1413059