增龄相关听力损失及卡那霉素致聋大鼠耳蜗TMPRSS3、ENaC-α基因表达的初步研究

发布时间：2018-01-20 08:16

  本文关键词： 增龄相关听力损失 耳蜗 卡那霉素 TMPRSS3 增龄相关听力损失 耳蜗 基因表达 ENaC-α　出处：《中南大学》2010年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 研究背景：跨膜丝氨酸蛋白酶3(TMPRSS3)为Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶家族成员,是第一个被发现的致聋的蛋白酶,其基因缺陷是非综合征型常染色体隐性遗传性聋DFNB8/10的遗传学基础,至今已发现该基因14种突变致聋形式,但对于该蛋白酶的功能及其作用机制仍不清楚。 目的：本研究在增龄相关性听力损失和卡那霉素致聋的SD大鼠模型上,通过检测耳蜗中TMPRSS3基因的表达特点,初步探讨其在增龄相关性听力损失及药物中毒性聋中的作用。 方法：用于卡那霉素致聋研究的大鼠均为3月龄,随机分为四组：Ⅰ组(对照组)：注射生理盐水14天；Ⅱ组(卡那霉素3日组)：肌注硫酸卡那霉素,连续3天；Ⅲ组(卡那霉素7日组)：肌注硫酸卡那霉素,连续7天；Ⅳ组(卡那霉素14日组)：肌注硫酸卡那霉素,连续14天。用于增龄相关性聋的大鼠按月龄分为三组：3月龄组、12月龄组、24月龄组。通过听性脑干反应(ABR)测试确定各组8 kHz和16kHz的听反应阈。应用免疫组化技术检测各组大鼠耳蜗中TMPRSS3蛋白的表达与分布情况。应用Western blot技术检测耳蜗中TMPRSS3蛋白表达水平。应用荧光定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)对大鼠耳蜗中TMPRSS3基因的mRNA表达水平进行检测。 结果：1.卡那霉素致聋大鼠：(1)听功能改变：ABR反应阈由高到低依次为：卡那霉素14日组卡那霉素7日组卡那霉素3日组,而对照组与注射3日组之间ABR反应阈值无明显差异。(2)免疫组化染色：TMPRSS3蛋白在各组SD大鼠耳蜗中均有表达,随注射时间延长,染色阳性程度变弱。(3)Western blot检测：TMPRSS3蛋白在耳蜗的表达浓度随着注射时间延长而减弱。(4)RT-PCR分析：抽提耳蜗组织总RNA电泳结果OD260/280在1.9-2.0之间。TMPRSS3基因的mRNA表达水平随注射时间延长而逐渐下降。 2.增龄相关性听力损失大鼠：(1)听功能改变：在16kHz, ABR反应阈由高到低依次为：24月龄组12月龄组3月龄组,各组间均有显著差异(P0.01)。在8kHz,24月龄组较3月龄及12月龄组大鼠阈值增高,而3月龄和12月龄组之间无显著差异；(2)免疫组化染色：随月龄增长,TMPRSS3蛋白耳蜗染色阳性程度变弱。(3)Western blot检测：大鼠耳蜗中TMPRSS3蛋白.表达浓度随年龄增长而减弱。(4)RT-PCR分析：TMPRSS3 mRNA表达水平随月龄增长而减弱,各组间均有显著差异。 结论：TMPRSS3在SD大鼠耳蜗螺旋器和螺旋神经节细胞均有表达。SD大鼠耳蜗中TMPRSS3蛋白和mRNA表达水平随注射硫酸卡那霉素时间增长和月龄增长而逐渐降低。各实验组TMPRSS3蛋白和mRNA表达水平与听功能保存程度基本一致。上述结果提示TMPRSS3可能在药物中毒和老年性聋的发生中起作用。 研究背景：表皮钠通道蛋白(ENaC)属于ENaC/Deg家族,是由3个同源亚基α、β、γ组成的多聚体,分布于肾小管、结肠、呼吸道上皮细胞表面及耳蜗等处,在耳蜗其主要作用是维持内淋巴的低钠浓度。2002年Guipponi等利用体外爪蟾卵表达系统,证实了TMPRSS3能催化激活ENaC。也有研究发现TMPRSS3致聋的突变体无法激活ENaC。但目前对于ENaC在调节内耳内淋巴代谢、维持内耳正常功能方面的机制尚不清楚。 目的：本研究在对增龄相关性听力损失和卡那霉素致聋的SD大鼠,通过检测耳蜗中ENaC-α基因的表达特点,初步探讨其在老年性聋及药物性听力损失中的作用,及与TMPRSS3的关系。 方法：动物分组处理同第一部分,应用免疫组化技术,检测各组SD大鼠耳蜗中ENaC-α蛋白的表达与分布情况。应用Western blot技术,检测两类致聋模型大鼠耳蜗中ENaC-α的蛋白表达水平。应用荧光定量逆转录多聚酶链反应(RT-PCR),对大鼠耳蜗中ENaC-α基因的mRNA表达水平进行检测。 结果：1.卡那霉素致聋大鼠：(1)免疫组化染色：ENaC-α蛋白在各组SD大鼠耳蜗中均有表达,注射14日组大鼠较注射3日、7日组及对照组的大鼠耳蜗染色明显减弱,但注射3日、7日组及对照组之间无显著差异；(2)Western blot检测：对照组及注射3日、7日的大鼠耳蜗蛋白表达浓度无明显改变,注射14日组较前三组ENaC-α蛋白浓度明显降低。(3)RT-PCR分析：抽提耳蜗组织总RNA电泳结果OD260/280在1.9-2.0之间。注射3日、7日及对照组的大鼠耳蜗mRNA表达水平无明显改变,注射14日组ENaC-αmRNA表达水平较前三组减弱,有统计学显著差异。 2.增龄相关听力损失大鼠：(1)免疫组化染色：SD大鼠随月龄增长,耳蜗ENaC-α蛋白染色阳性程度减弱。(2)Western blot检测：ENaC-α蛋白表达浓度随大鼠月龄增长而降低。(3)RT-PCR分析：大鼠耳蜗ENaC-αmRNA表达水平随月龄增长逐渐减弱,有显著差异。 结论：ENaC-α在SD大鼠耳蜗Corti's器和螺旋神经节细胞均有表达。卡那霉素致聋大鼠耳蜗中ENaC-α蛋白和mRNA表达水平在给药后期明显降低；增龄相关听力损失大鼠随月龄增大而降低。ENaC-α的变化与TMPRSS3有相关性,提示TMPRSS3可能通过调节ENaC-α而起作用。
[Abstract]:Background: transmembrane serine protease 3 (TMPRSS3) is a type II transmembrane serine protease family members, is the first found of hearing loss caused by protease, the genetic defect is non genetic basis of syndrome type of autosomal recessive deafness DFNB8/10, has been found in the gene mutation of deafness caused by 14 kinds of forms, but the effect and mechanism of the protease function remains unclear.
Objective: To investigate the role of TMPRSS3 gene in aging related hearing loss and drug induced hearing loss in a SD rat model with hearing loss and kanamycin induced hearing loss.
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本文编号：1447510