内皮素-1在小梁网房水流出通道中的作用及机制研究
发布时间:2018-02-02 13:05
本文关键词: 青光眼 内皮素-1 小梁细胞 细胞外基质 纤维连接蛋白 Ⅳ胶原 吞噬 肌动蛋白 结缔组织生长因子 出处:《华中科技大学》2010年博士论文 论文类型:学位论文
【摘要】: 青光眼(glaucoma)是一组以视神经受损和视功能损害为共同特征的不可逆致盲眼病。病理性眼压(Introcular Pressure, IOP)升高是青光眼视神经受损的最主要危险因素。研究表明小梁网是房水(Aqueous humor, AH)流出的最关键部位,小梁网细胞外基质堆积,吞噬功能受损、小梁网细胞骨架的重构导致小梁网细胞形态、韧性、强度、细胞间黏附性改变等,是房水阻力增加、病理性眼压升高的主要原因。 内皮素-1(endothelin-1, ET-1)是一种小分子生物活性多肽,在调控血管舒缩、细胞增殖、分化等方面发挥重要作用。同时,ET-1还是一种强大的促纤维化因子,在肾、肺和心肌细胞外基质重构和纤维化方面扮演重要的角色,另外,ET-1通过活化Rho激酶导致血管内皮和肺上皮细胞等细胞骨架的重构。ET-1还是重要的促炎和促氧化应激因子,可以促进细胞分泌其他因子如ICAM-1,TNF-α,IL-1、IL-6等及过氧化物等,介导炎症和氧化应激反应。 最近,研究表明原发开角型青光眼(primary open angle glaucoma, POAG)、正常眼压青光眼(NormalTension Glaucoma, NTG),色素剥脱综合症患者和青光眼动物模型房水中的ET-1水平比正常明显升高,认为ET-1与青光眼发病密切相关。ET-1作为促纤维化、促氧化应激和细胞骨架调节因子,在小梁网的细胞外基质合成、吞噬功能、细胞骨架重构方面的作用尚不清楚。本研究拟通过以下四部分的研究系统观察ET-1对小梁细胞功能的影响:1.ET-1对体外培养人小梁网细胞(human trabecular meshwork cells, HTMCs)的细胞外基质----纤维连接蛋白(fibronectin, FN)、Ⅳ型胶原(typeⅣcollagen, ColⅣ)表达的影响,及ET-1对灌注培养人眼前段小梁网组织中FN、ColⅣ表达及眼压的影响;2.观察CTGF在ET-1促HTMCs合成FN、ColⅣ中的作用;3.观察ET-1对HTMCs吞噬功能的影响;4.观察ET-1对HTMCs细胞骨架蛋白F-actin的表达及重构的影响。以期探明ET-1在调控小梁网房水流出的作用及其分子机制,为POAG降眼压治疗提供新的理论依据。 第一部分:ET-1对小梁网FN和Ⅳ型胶原表达的作用研究 目的:1.观察ET-1及ET受体(ETR)拮抗剂对体外培养人小梁细胞(HTMCs)中纤维连结蛋白(FN)和Ⅳ型胶原(ColⅣ)表达的影响。 2.观察ET-1对灌注培养人眼前段小梁网组织中FN、ColⅣ表达及眼压的影响。 方法:1.体外培养HTMCs,并用抗神经元特异性烯醇酶(neurone specific enolase, NSE)、纤维连结蛋白(fibronectin, FN)、层粘连蛋白(laminin, LN)、Ⅷ因子相关抗原(FactorⅧrelated antigen, FⅧRag)免疫组织化学染色鉴定HTMCs。 2.ET-1及ETR拮抗剂对体外培养HTMCs中FN、ColⅣ表达的影响:取传3代HTMCs,①观察不同浓度ET-1对HTMCs中FN和ColⅣ表达的影响,实验分为4组:对照组(0 mol/L ET-1);ET-1低剂量组(10-9 mol/L);ET-1中剂量组(10-8mol/L);ET-1高剂量组(10-7mol/L),各组细胞分别孵育72h后,Weston-blot检测FN、ColⅣ的表达;②观察ETR拮抗剂对HTMCs中FN,ColⅣ表达的影响,实验分为4组:对照组;ET-1组干预组(10-7mol/L ET-1);ETAR拮抗剂干预组(10-7mol/L ET-1+10-7mol/L BQ123):ETBR拮抗剂干预组(10-7 mol/L ET-1+10-7mol/LBQ788),各组细胞分别孵育72h后,免疫荧光染色、Weston-blot检测FN、ColⅣ的表达。 3.ET-1对灌注培养人眼前段小梁网组织FN和ColⅣ表达及眼压的影响:①建立人眼前段灌注培养模型;②取人眼(n=3对)灌注培养24h,记录基线眼压,然后分为对照眼(左眼),ET-1干预眼(右眼);对照眼给予DMEM灌注培养,ET-1干预眼给予10-7mol/L ET-1灌注培养,记录干预后不同时点(6h,12h,18h,24h,30h,36h,42h,48h,54h,60h,66h,72h)对照眼和干预眼眼压;72h后人眼前段行4%多聚甲醛固定,石蜡切片,免疫荧光检测人眼小梁网组织中FN、ColⅣ的表达。 结果:1.体外培养HTMCs呈NSE、FN、LN阳性表达,FⅧRag阴性表达,体外培养成功。 2.ET-1及ETR拮抗剂对体外培养HTMCs中FN和ColⅣ表达的作用:①10-9~10-7mol/LET-1干预后HTMCs中FN表达上调,呈剂量依赖性,差异有统计学意义(P0.01);10-8~10-7mol/L ET-1干预后HTMCs中ColⅣ表达明显上调,差异有统计学意义(P0.01); ②给予ETAR拮抗剂BQ123后,与ET-1组相比,HTMCs中FN、ColⅣ的表达降低(P0.05);但给予ETBR拮抗剂BQ788后,HTMCs中FN、ColⅣ的表达无明显变化(P0.05)。 3.ET-1对灌注培养人眼前段小梁网组织中FN和ColⅣ表达及眼压的影响: ①10-7mol/L ET-1干预灌注培养的人眼前段后,小梁网组织中FN和ColⅣ表达和分布明显增多。 ②正常人眼前段基线眼压波动在15~20mmHg左右,对照眼基线眼压分别为:15,18,20mmHg,ET-1干预眼基线眼压分别为16,19,19mmHg,给予ET-1干预后眼压升高,72h后眼压分别为24,26,27mmHg,明显高于对照眼眼压16,19,20mmHg。 结论:1.ET-1能够促进体外培养HTMCs中FN、ColⅣ的表达,其作用是通过激动ETAR起作用的。 2.ET-1能够促进体内灌注培养人眼前段小梁组织中FN、ColⅣ的表达,并导致灌注培养模型眼眼压增高。 第二部分:CTGF在ET-1促小梁细胞FN和Ⅵ胶原表达中的作用研究 目的:观察结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)在ET-1促HTMCs合成FN和ColⅣ中的作用 方法:取传三代HTMCs①观察不同时间点ET-1对小梁细胞CTGF、FN和ColⅣmRNA的影响。实验分为4组:正常对照组、24h干预组,48h干预组,72h干预组,给予10-7molET-1干预HTMCs,于不同时间点收集细胞,用RT-PCR观察CTGF、FN和ColⅣmRNA的变化。②设计并合成4条CTGF反义寡核苷酸(CTGF-ASDON)序列,转染传三代培养人HTMCs,RT-PCR检测其干扰效率,选择效果最有效的CTGF-ASDON序列进行后续实验。③观察CTGF-ASDON在ET-1促HTMCs中FN和ColⅣ表达的影响:选择传三代培养HTMCs,随机分为5组,A:正常对照组(单纯DMEM)、B:ET-1干预组(DMEM+10-7mol ET-1)、C:单纯CTGF-ASDON组(DMEM+脂质体+100nmol/LCTGF-ASDON)、D组:脂质体对照组(DMEM+脂质体)、E组:CTGF-ASDON+ET-1组(DMEM+10-7molET-1+脂质体+100nmol/LCTGF-ASDON),转染24h后收集细胞,提取细胞总蛋白,Western-blot检测CTGF、FN和ColⅣ的表达。 结果:①给予ET1后,HTMCs中CTGF、FN和ColⅣmRNA水平较对照组明显上调(P0.01),CTGFmRNA水平在48h达到高峰,FN和ColⅣmRNA在72h达到高峰,(P0.01)。 ②合成CTGF-ASDON序列转染HTMCs后,CTGF-ASDON1干扰效率最佳,能下调CTGFmRNA水平达40%。 ③CTGF-ASDON+ET-1组与ET-1组相比,HTMCs中FN和ColⅣ表达明显降低(P0.05) 结论:下调CTGF后可减少ET-1促进HTMCs中FN、ColⅣ的表达,CTGF是ET-1促HTMCs合成FN和ColⅣ的重要的下游信号分子。 第三部分ET-1对体外培养人小梁细胞吞噬功能的作用研究 目的:观察ET-1及ETR拮抗剂对体外培养HTMCs吞噬功能的影响。 方法:取传3代培养的HTMCs,①观察HTMCs吞噬动力学:HTMCs与直径0.5μm荧光标记的乳胶微粒共孵育0、4、8、12、24、48、72h,荧光显微镜下动态定量观察吞噬乳胶颗粒数。②观察不同浓度ET-1对HTMCs吞噬功能的影响:实验分为四组,对照组;ET-1低剂量组(10-9mol/L);ET-1中剂量组(10-8 mol/L);ET-1高剂量组(10-7mol/L),·与0.5μm乳胶颗粒共孵育24h后观察各组HTMCs吞噬乳胶颗粒数。③观察ETR拮抗剂对吞噬功能的影响:实验分为4组,对照组;ET-1组;ETAR拮抗剂组(ET-1+10-7mol/L BQ123);ETBR拮抗剂组(ET-1+10-7mol/L BQ788),其中ET-1的浓度为10-8 mol/L,并与0.5μm乳胶颗粒共孵育24h,观察各组HTMCs吞噬乳胶颗粒数。 结果:①HTMCs吞噬动力学示:HTMCs与乳胶颗粒共孵育4h时细胞后可见明显的吞噬颗粒,随时间延长吞噬微粒数明显增多,24h吞噬微粒密度最佳,48h吞噬微粒达到饱和,细胞形态改变;24h是实验观察的最佳时点。 ②加入10-9~10-7mol/LET-1干预后,HTMCs吞噬乳胶微球数明显减少,呈浓度依赖性(P0.05); ③给予ETR拮抗剂干预后:ETAR拮抗剂组吞噬颗粒较ET-1组明显增多(P0.05),而ETBR拮抗剂组与ET-1组相比差异无统计学意义(P0.05)。 结论:ET-1能抑制体外培养的HTMCs吞噬能力;ET-1主要通过ETAR来发挥其抑制吞噬作用。 第四部分ET-1对体外培养人小梁细胞骨架蛋白F-actin的作用研究 目的:观察ET-1对HTMCs细胞骨架蛋白F-actin表达的影响。 方法:取培养3代HTMCs,随机分为四组:对照组(0 mol/L ET-1);ET-1低剂量组(10-9mol/L);ET-1中剂量组(10-8mol/L);ET-1高剂量组(10-7mol/L),ET-1处理72h后,收集细胞,提取细胞总蛋白,应用Western-blot方法检测HTMCs中骨架蛋白F-actin的表达,并用FITC-phalloidin荧光探针观察F-actin在HTMCs内的分布。 结果:①ET-1作用后HTMCs中F-actin表达明显增高,在10-9~10-7mol/L浓度范围内呈剂量依耐性(P0.05);②荧光探针示ET-1组HTMCs中F-actin应力纤维和周边肌动蛋白明显增多、浓集,分布紊乱,细胞边缘僵硬锐利;细胞-细胞、细胞-细胞外基质间黏结明显增多。 结论:ET-1促进HTMCs中F-actin的表达增多、细胞黏结形成,导致细胞骨架重构。 研究总结 一、主要研究结果 1.本研究证实:ET-1能够通过ETA受体促进体外培养HTMCs中FN及ColⅣ的表达;进一步发现ET-1能够促进灌注培养人眼前段小梁组织中FN及ColⅣ的表达,并导致灌注培养人眼前段的眼压升高。推测ET-1可能在POAG患者小梁细胞外基质堆积和房水流出阻力中发挥重要作用。 2.下调CTGF能明显抑制ET-1促HTMCs中FN、ColⅣ的表达,提示CTGF可能是ET-1介导FN、ColⅣ表达的重要下游信号分子。 3. ET-1能够通过ETA受体抑制体外培养HTMCs的吞噬功能。 4.本研究证实ET-1促进体外培养HTMCs细胞骨架蛋白F-actin的表达,导致细胞骨架重构; 二、研究结论 ET-1可能通过促进HTMCs细胞外基质(如FN、ColⅣ)表达、细胞骨架重构(如F-actin)和抑制吞噬功能等多方面影响小梁细胞功能,导致房水流出受阻,眼压升高。通过给予ETA受体抑制剂或下调CTGF的表达,可能有望改善小梁细胞整体功能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:华中科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R775
【参考文献】
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2 陈飞,魏厚仁,曾艳彩,吕源淑,张樱(;维拉帕米对牛眼小梁细胞增殖和吞噬功能的影响[J];眼科研究;2003年03期
3 王小刚;吴慧娟;陈琦;赵仲华;张志刚;郭慕依;;转染结缔组织生长因子基因的大鼠肾系膜细胞纤连蛋白和Ⅳ型胶原表达的改变[J];中华病理学杂志;2006年09期
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,本文编号:1484577
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