阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者端粒长度的变化及意义的研究

发布时间：2018-02-03 20:38

本文关键词： 阻塞性睡眠呼吸暂停综合征端粒白细胞　出处：《南方医科大学》2011年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景：端粒(Telomere)是位于真核生物线性染色体末端的特殊序列,由端粒DNA和端粒结合蛋白组成,起保护和稳定染色体的作用。早在20世纪30年代,诺贝尔奖得主Hermnn Muller和Barbara Mcclintock就已经观测到染色体的末端结构在避免染色体之间的融合中起了重要的作用,从而猜测它可能有保护染色体的作用。1978年,Blackburn发现了富含小染色体的模式生物四膜虫的端粒含有许多重复的5'-CCCCAA-3'六碱基序列,与此同时,Szostak发现微型染色体在导入酵母后会很快被降解这一现象,于是这两位科学家将四膜虫的CCCCAA序列偶联到微型染色体上并导入酵母,结果发现这段端粒序列的加入使得微型染色体免受降解,从而证实了端粒对染色体的保护作用。进一步的研究发现,端粒可通过形成t-loop紧凑结构,或者与Shelterin等端粒保护蛋白结合,从而防止染色体降解、避免末端融合,进一步调节细胞生长.随着体细胞的不断增殖,端粒会逐渐缩短,当端粒缩短至一定程度,细胞停止分裂,进入静止状态,故有人称端粒为正常细胞的“分裂钟”(mistosis clock). Benetos等对193例平均年龄为56岁的人群进行端粒平均长度的测量,发现端粒长度与人年龄成负相关的关系；Lee对猴子外周血单核细胞测量端粒长度发现,端粒每年相应缩短62.7 bp。端粒长度可以作为研究细胞衰老与生物体年龄的一种很好的方式。近几年对中老年人群中发生睡眠呼吸暂停综合征(sleep apnea sylndrome, SAS),尤其是阻塞型睡眠呼吸暂停综合征(obstructive sleep apnea syndrome, OSAS)的研究越来越多,国外对该病的研究已有30余年,国内也有近20年。SAS是一严重的睡眠呼吸障碍性疾病,是由于某些原因而致上呼吸道阻塞,睡眠时有呼吸暂停,伴有缺氧、鼾声、白天嗜睡等症状的一种较复杂的疾病。好发于肥胖者及中老年人,4050岁年龄段患病率较高,国外报道成年男性发病率为4%,女性发病率为2%,我国人群发病率为3.4%。目前35岁左右的患者发病也有上升趋势。小儿的发病率约为1%-2%,男女发病率无差异,可见于各年龄阶段,但以学龄前期最为多见。 SAS主要临床表现为睡眠时打鼾,且鼾声不规则,伴有呼吸暂停和呼吸表浅,有时憋醒,夜间反复的呼吸暂停和低通气导致动脉血氧饱和度下降和组织缺氧,患者会表现为夜尿增多,晨起头痛,白天乏力,嗜睡,严重者还可出现记忆力、智力下降,性格改变和性欲减低,许多研究报道OSAS会引致脑血管疾病、精神异常、肺心病和呼吸衰竭,糖尿病,性欲减退等一系列的并发症,最直接的就是会诱发高血压,导致冠心病；在脑卒中人群中高达60%。有1/5的心脏病是由睡眠呼吸暂停综合征引起,其并发症造成多脏器功能损害严重者甚至意识丧失,猝死,严重的影响患者的生活质量和寿命。但目前人们对OSAS的严重后果不了解,对OSAS早期预防、早期诊断与早期治疗认识不足,不主动前来就医,很多病例多是出现严重的心、脑、肺、肾等并发症时才就诊,以致错过治疗时机,睡眠医学是近年来新兴的一门边缘学科,SAS越来越受到医学界和社会各界的重视,尤其是OSAS对机体影响的研究也越来越广泛越深入,对患者做到健康教育及早期诊断与早期治疗是一项非常重要的工作。有越来越多的研究报道说明端粒长度与冠心病、心血管疾病、肿瘤、胃癌、肠癌、肝癌、糖尿病、尿毒症等疾病有关,所以关于端粒长度变化规律的各种机制的提出,无疑是生物医学领域的重大突破,随着我们不断的发现和掌握端粒长度及其变化规律,可以看出通过端粒长度估计个体的即时年龄和预期寿命,阐述衰老机理；运用细胞端粒长度蕴涵的临床病理参数和信息来调查缺氧的生物学行为和发生模式,把端粒长度作为缺氧的一种诊断依据和临床治疗指征;解决OSAS组织工程中细胞的老化问题,为阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)的治疗提供理论基础。研究目的探讨阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)患者外周血白细胞端粒长度的变化及意义。研究对象根据2007年美国睡眠医学会(American Academy of Sleep Medicine, AASM)的多道睡眠图分析标准,选择OSAS患者11例,健康对照组10例,提取外周血白细胞DNA,纯度检测合格后,用Q-PCR法检测端粒长度相对T/S比率。研究方法 1实验用品材料两组受试者的外周静脉全血5ml, EDTA抗凝,置于-80℃冰箱中保存待测；定量PCR专用8联管及及管盖。试剂Takara Blood Genome DNA Extraction试剂盒,SYBR(?) Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒,异丙醇,乙醇,1X TE缓冲液 T反应引物：tell GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGGTte12 TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTA S反应引物：36b4u CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC 36b4d CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA 设备水浴箱,紫外分光光度仪,ABI PRISM(?) 7500实时荧光定量PCR仪。 2实验方法基因组DNA的抽提采用Takara Blood Genome DNA Extraction试剂盒抽提全血基因组DNA,测定浓度后,筛选合格标本进行实验,稀释DNA浓度到约20 ng/μL浓度。 DNA浓度及纯度的测定采用Eppendof Biophotometer测定提取的DNA浓度及A260/280比值,选择合格标本进行实验。进行PCR反应的设置 T/S比率的计算采用荧光定量PCR仪配套软件,分别确定T反应及S反应的Ct值——Ct (telomeres)及Ct (36B4),根据PCR反应产物以2的指数倍递增原理,T/S比率应该接近于公式[2Ct(telomeres)/2Ct(36B4)]-1-2-ΔCt 3统计方法所得数据用统计软件SPSS13.0进行分析。组间差异的显著性分析用两个独立样本的t检验。数据间的相关性用Pearson相关分析法。结果 1.端粒长度相对T/S比率的比较本研究中,OSAS组端粒相对长度T/S比率为3494.71±2531.04,健康对照组端粒长度相对T/S比率为67536.01±87431.93,OSAS组端粒相对长度T/S比率较健康对照组小,二者之间存在统计学差异(P0.05) 2.端粒长度相对T/S比率与年龄、BMI、AHI、病程、病情分级的相关关系 OSAS组端粒长度相对T/S比率与年龄、BMI、AHI、病程、病情分级等均无显著的相关性(P0.05)。健康对照组端粒长度相对T/S比率与年龄呈负相关,r=-0.713,P=0.021,但与BMI也无显著相关性(P0.05) 结论 OSAS患者外周血白细胞端粒长度的缩短可能与其发病机制有关,低氧血症和高碳酸血症加速了端粒的损耗和细胞的凋亡。 OSAS所引起的慢性缺氧和(或)高碳酸血症可能加速了端粒的损耗和细胞的凋亡,影响人类的健康与寿命,我们应当积极预防和治疗OSAS。呼吸暂停可导致低氧血症(P02↓),高碳酸血症(PCO2T),甚至pH失代偿,血氧饱和度可降到60%-80%。严重低氧可引起儿茶酚胺、肾素血管紧张素和内皮素分泌增加,微血管收缩,内分泌、神经调节功能失调,血流动力学和流变学改变,微循环异常使组织器官缺血、缺氧加重而导致多系统器官损害。目前的研究已知OSAS对心血管系统、呼吸系统、脑血管和中枢神经系统、内分泌和性功能、肾脏和血液系统等存在危害,尚未发现OSAS与端粒长度变化的关系。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R766

【参考文献】