基于调节SIRT1维生素C保护视网膜色素上皮免受氧化应激损伤

发布时间：2018-02-16 09:57

  本文关键词： 维生素C 视网膜色素上皮细胞 年龄相关性黄斑变性 SIRT1 氧化应激反应　出处：《武汉大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的： 氧化应激反应一直被认为是年龄相关性黄斑变性(AMD)最常见的病因。防止视网膜色素上皮细胞的氧化损伤将有望成为AMI)的治疗方法。在此研究中,目的是研究氧化应激状态下维生素C作为抗氧化剂对视网膜色素上皮细胞的保护作用以及维生素C和SIRT1之间的调节机制。 方法： 1人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤模型的建立以及维生素C保护作用的观察。外源性过氧化氢(H202)梯度浓度作用于ARPE-19细胞,观察细胞形态变化,MTT方法检测细胞活力,2’7’-二氯荧光乙酰乙酸钠(DCFH-DA)荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)的生成,确定H202的适合作用浓度(100μmol)。梯度浓度的维生素C作用于氧化应激下的ARPE-19细胞,检测细胞存活率、细胞凋亡和细胞内ROS的改变。 2氧化应激状态下ARPE-19细胞在维生素C预处理后检测SIRT1、p53和Foxo3基因的表达。适当浓度(100μmol)的H202作用于ARPE-19细胞12小时或24小时,用梯度浓度(0μmol、20μmol、100μmol、500μmol)的维生素C预处理后,用定量即时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测SIRT1转录因子及应激反应因子p53和Foxo3基因表达。 3氧化应激状态下ARPE-19细胞在维生素C预处理后,用100mmol的白藜芦(RSV)和5mmol的烟酰胺(NA)作用于细胞。使用靶向siRNA对SIRT1进行敲除,作为阴性对照。观察RSV和NA对不同浓度梯度维生素C作用下的ARPE-19细胞的生存活力、细胞凋亡和细胞内ROS水平的影响。 4Western Blot法检测在敲除或上调SIRT1表达后p53和Foxo3基因表达及蛋白表达的影响。在氧化应激状态下,用l00μmo1浓度的维生素C预处理ARPE-19细胞后用Western Blot法检测在敲除或上调SIRT1基因表达后,ARPE-19细胞p53和Foxo3基因表达以及蛋白表达的情况。 结果： 1外源性H202作用下,ARPE-19细胞生存力下降且呈剂量依赖性及时间依赖性,同时ARPE-19细胞内ROS水平上升,提示H202处理后可诱导ARPE-19细胞的氧化应激损伤。考虑到人体自然状态下,RPE所受到的氧化应激损伤是低强度、长时间的累积效应,所以H202的适合作用浓度确定为100μmol。维生素C处理后,中等浓度的维生素C显著提高了ARPE-19细胞氧化应激下的生存率,同时显著降低细胞内ROS水平以及细胞凋亡率。而低浓度和高浓度的维生素C无此作用。 2维生素C影响SIRT1转录因子和应激反应因子(p53和Foxo3)的表达。H202可减少SIRT1的表达。当维生素C浓度达到100μmol时,不仅可显著增加SIRT1的表达,而且也显著提高了p53和Foxo3的基因表达水平。 3SIRT1参与维生素C的抗氧化保护作用。SIRT1激动剂RSV不仅可显著激发维生素C的保护作用,还能使更低浓度和更高浓度维生素C具有抗氧化性能。与此同时,SIRT1抑制剂NA可减轻中等浓度维生素C的抗氧化保护作用。 4氧化应激状态状态下,在敲除或上调SIRT1表达后,观察维生素C对RPE细胞p53和Foxo3基因及蛋白的表达情况。结果显示p53和Foxo3的调节异常依赖于SIRT1的调节而不是维生素C。 结论： 1外源性H202可诱导人视网膜色素上皮细胞ARPE-19细胞发生氧化应激反应,导致细胞损伤。适当浓度的维生素C可降低细胞内氧化应激水平,减少ARPE-19细胞损伤及凋亡,起到抗氧化损伤保护作用。 2维生素C的抗氧化应激损伤的保护作用涉及SIRT1基因的调控。 3联合应用维生素C和白藜芦醇(RSV)可有效抵御视网膜色素上皮细胞免受氧化应激损伤,此项研究将为维生素C和白藜芦醇(RSV)联合应用治疗AMD提供依据。
[Abstract]:Objective:
Oxidative stress has been considered the age-related macular degeneration (AMD) is the most common cause. To prevent oxidative damage of retinal pigment epithelial cells is expected to become AMI) treatment. In this study, the purpose is to study the oxidative stress state of vitamin C as antioxidant agent between the protective effect on retinal pigment epithelial cells and vitamin C SIRT1 and the regulatory mechanism.
Method锛，

本文编号：1515243