脐带间充质干细胞修复鼻黏膜放射性损伤的效果和机制研究

发布时间：2018-02-16 12:44

本文关键词：脐带间充质干细胞流式细胞术分化绿色荧光蛋白腺病毒间充质干细胞鼻黏膜放射性损伤干细胞移植条件培养液旁分泌分化迁徙趋化作用 β-Tubulin 共培养　出处：《复旦大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分人脐带间充质干细胞的分离、培养、鉴定及荧光标记目的：探讨分离,培养,鉴定,荧光标记人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的方法,研究其生物学特性,为后期动物实验及体外实验做准备。方法：分别用酶消化法和组织块法分离培养hUC-MSCs,用含10%FBS的DMEM/F12培养基,在37℃、5%CO2条件下进行培养,每3-4 d按照1：3比例传代。倒置显微镜观察细胞形态,统计开始收获原代(P0)细胞的时间和PO细胞的产量,CCK8法检测细胞增殖能力,台盼蓝染色检测冻存复苏活细胞比例。通过观察细胞贴壁能力,流式细胞术检测细胞表型,体外成脂、成骨、成软骨定向诱导检测分化能力,鉴定其是否符合间充质干细胞国际标准。用携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体(Ad-GFP)转染hUC-MSCs标记细胞,流式细胞术检测标记效率。结果：hUC-MSCs呈长梭形,贴壁生长,细胞密集时呈放射状或漩涡状排列。酶消化法细胞收获PO细胞时间早于组织块法(7.75±2.50 d VS 11.00±0.82 d),但产量低于后者(1±0.24×105/cm VS 1±0.42×106/cm)。两种方法获得细胞增殖能力,冻存复苏活细胞比例无明显差异。两种方法获得细胞都能在塑料培养容器上贴壁,流式检测阳性表达率依次是CD45 (0.437%), CD90 (96.7%), CD105 (34.9%), CD146 (92.4%),在体外诱导环境下能向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞分化。Ad-GFP转染hUC-MSCs后可见较强绿色荧光,流式检测GFP阳性率94.4%。结论：酶消化法和组织块法均可获得足量原代hUC-MSCs,通过细胞形态,表型,成骨,成脂,成软骨分化鉴定证明符合国际干细胞协会标准。Ad-GFP转染hUC-MSCs具有效率高,荧光强的特点。第一部分人脐带间充质干细胞的分离、培养、鉴定及荧光标记目的：探讨分离,培养,鉴定,荧光标记人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的方法,研究其生物学特性,为后期动物实验及体外实验做准备。方法：分别用酶消化法和组织块法分离培养hUC-MSCs,用含10%FBS的DMEM/F12培养基,在37℃、5%CO2条件下进行培养,每3-4 d按照1：3比例传代。倒置显微镜观察细胞形态,统计开始收获原代(P0)细胞的时间和PO细胞的产量,CCK8法检测细胞增殖能力,台盼蓝染色检测冻存复苏活细胞比例。通过观察细胞贴壁能力,流式细胞术检测细胞表型,体外成脂、成骨、成软骨定向诱导检测分化能力,鉴定其是否符合间充质干细胞国际标准。用携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体(Ad-GFP)转染hUC-MSCs标记细胞,流式细胞术检测标记效率。结果：hUC-MSCs呈长梭形,贴壁生长,细胞密集时呈放射状或漩涡状排列。酶消化法细胞收获PO细胞时间早于组织块法(7.75±2.50 d VS 11.00±0.82 d),但产量低于后者(1±0.24×105/cm VS 1±0.42×106/cm)。两种方法获得细胞增殖能力,冻存复苏活细胞比例无明显差异。两种方法获得细胞都能在塑料培养容器上贴壁,流式检测阳性表达率依次是CD45 (0.437%), CD90 (96.7%), CD105 (34.9%), CD146 (92.4%),在体外诱导环境下能向脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞分化。Ad-GFP转染hUC-MSCs后可见较强绿色荧光,流式检测GFP阳性率94.4%。结论：酶消化法和组织块法均可获得足量原代hUC-MSCs,通过细胞形态,表型,成骨,成脂,成软骨分化鉴定证明符合国际干细胞协会标准。Ad-GFP转染hUC-MSCs具有效率高,荧光强的特点。第二部分hUC-MSCs修复豚鼠鼻黏膜放射性损伤的效果目的：检测hUC-MSCs静脉注射和条件培养液滴鼻对豚鼠鼻黏膜放射性损伤模型的治疗效果。方法：构建豚鼠鼻黏膜放射性损伤模型,静脉注射hUC-MSCs或鼻腔滴注hUC-MSCs浓缩条件培养液干预,正常豚鼠和放疗但不干预豚鼠作为对照,在放疗结束后1周,1月,3月,6月分别用炭末法检测豚鼠鼻黏膜粘液纤毛清除时间(MCT),鼻黏膜切片HE染色观察病理改变,扫描电镜观察黏膜纤毛覆盖率及纤毛形态评估治疗效果。结果：hUC-MSCs静脉注射和条件培养液滴鼻组在放疗结束后1周,1月时,粘液纤毛清除时间,黏膜水肿程度均优于放疗对照组。放疗后第6月条件培养液滴鼻组纤毛覆盖率及纤毛形态优于放疗对照组。结论：hUC-MSCs静脉注射和条件培养液滴鼻对豚鼠鼻黏膜放射性损伤模型有治疗作用。方法：构建豚鼠鼻黏膜放射性损伤模型,静脉注射hUC-MSCs或鼻腔滴注hUC-MSCs浓缩条件培养液干预,正常豚鼠和放疗但不干预豚鼠作为对照,在放疗结束后1周,1月,3月,6月分别用炭末法检测豚鼠鼻黏膜粘液纤毛清除时间(MCT),鼻黏膜切片HE染色观察病理改变,扫描电镜观察黏膜纤毛覆盖率及纤毛形态评估治疗效果。结果：hUC-MSCs静脉注射和条件培养液滴鼻组在放疗结束后1周,1月时,粘液纤毛清除时间,黏膜水肿程度均优于放疗对照组。放疗后第6月条件培养液滴鼻组纤毛覆盖率及纤毛形态优于放疗对照组。结论：hUC-MSCs静脉注射和条件培养液滴鼻对豚鼠鼻黏膜放射性损伤模型有治疗作用。第三部分hUC-MSCs修复鼻黏膜放射性损伤的机制研究目的：探讨hUC-MSCs修复鼻黏膜放射性损伤的机制。方法：携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体(Ad-GFP)标记hUC-MSCs,经静脉注射到豚鼠模型,注射后第3天,10天,20天,30天取鼻黏膜冰冻切片,采用荧光显微镜下直接观察和免疫荧光染色方法检测GFP标记细胞迁徙、分化情况。体外培养并鉴定人鼻黏膜上皮细胞,与hUC-MSCs共培养,观察hUC-MSCs的形态学变化,能否表达鼻黏膜上皮细胞特异性蛋白,对放疗后鼻黏膜上皮细胞的趋化作用,hUC-MSCs条件培养液对鼻黏膜上皮细胞增殖的影响等指标,探讨hUC-MSCs修复鼻黏膜放射性损伤的机制。结果：Ad-GFP标记hUC-MSCs在注射后3天和10天冰冻切片荧光显微镜可直接观察到标记细胞,注射后20天仅能通过免疫荧光染色检测到GFP蛋白,主要位于黏膜固有层,不能表达β-Tubulin蛋白。人鼻黏膜上皮细胞与hUC-MSCs直接共培养,部分hUC-MSCs形态发生变化,可表达上皮细胞特异蛋白角蛋白。hUC-MSCs对放疗后鼻黏膜上皮细胞有趋化,hUC-MSCs条件培养液可促进鼻黏膜上皮细胞增殖。结论：hUC-MSCs可能通过旁分泌机制促进豚鼠放射性损伤鼻黏膜粘液纤毛系统功能恢复。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R765.25

【参考文献】