细胞粘附分子2在鼻咽癌中的表达及其功能研究

发布时间：2018-02-26 13:41

本文关键词： CADM2 增殖细胞周期阻滞抑癌基因　出处：《第二军医大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：鼻咽癌是一种低分化、高侵袭性的肿瘤，恶性程度非常高。它在我国广东省中部地区是一种常见的恶性肿瘤，其在东南亚、北非和中东部分地区也属高发肿瘤。目前我国各地的鼻咽癌发病率逐年上升，加强对其进行预防、早期发现和治疗迫在眉睫。在发病机制上，目前认为EB病毒、遗传易感性、饮食和环境因素等是诱发鼻咽癌的几大重要因素。这些因素单独或联合作用，可导致多个基因和表观遗传学的改变，其中抑癌基因的失活或表达缺失与鼻咽癌的发生有着密切的关系，但鼻咽癌的分子发病机制仍不完全清楚。鼻咽癌的初发症状不明显，发生部位较为隐蔽，给临床的诊断和治疗上带来了极大的困难，多数病人在确诊时已为中、晚期且常伴有转移。目前鼻咽癌的主要治疗方法为放射治疗，治疗后五年生存率低于60%。因此迫切需要我们进一步阐明鼻咽癌发病的分子机制、挖掘有价值的用于早期诊断和治疗的生物靶标。 CADMs（Cell Adherin Molecules）家族属于免疫球蛋白超家族，目前发现由4个成员组成，包括CADM1、CADM2、CADM3和CADM4。该家族4个分子在结构上非常相似，均由3个Ig样结构域、单次跨膜区域和一个含有蛋白4.1作用序列和II型PDZ基序的短胞浆区组成。据报道CADMs家族成员通过Ig样结构域来调节细胞间粘附，从而影响细胞生物学行为；其胞内段蛋白4.1结合基序和II型PDZ基序可与相应的配体结合，参与细胞骨架的形成、细胞运动及细胞内信号的传导等。近年来，有关这个家族的研究越来越多，但主要集中在对CADM1的研究。研究发现，在多种肿瘤中（包括小细胞肺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、食管癌和胃癌等）发现CADM1普遍存在启动子甲基化和表达下调，且CADM1的表达缺失与肿瘤的恶性程度、病理分级分期密切相关。在功能上发现CADM1在多种肿瘤细胞中具有抑制细胞增殖、细胞粘附和转移的作用，且在上皮细胞、干细胞静息和损伤修复等方面也发挥着重要的作用。而在血液系统肿瘤研究中，CADM1的表达下调促使肿瘤细胞易于逃脱宿主系统的免疫监视，从而导致肿瘤的发生。该家族其他分子如CADM3和CADM4也被发现在胶质瘤细胞和前列腺癌细胞中表达下调或缺失，表明它们与肿瘤的发生也密切相关。近年来，CADMs家族另一个分子CADM2的表达与功能越来越受到学者们的关注。研究发现CADM2在前列腺癌、肾癌和肝癌等肿瘤中表达缺失或下调，且其表达下调与甲基化相关，提示CADM2可能在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。而CADM2在与鼻咽癌中的表达及其作用还未见相关报道。本文将通过检测CADM2在鼻咽癌中的表达，阐明CADM2基因在鼻咽癌细胞中的生物学功能及其作用的分子机制。在本课题中，我们首先通过半定量PCR方法检测CADM2在多种鼻咽癌细胞系中的mRNA表达水平。构建携带CADM2基因的慢病毒表达系统，感染CADM2低表达的鼻咽癌细胞，再通过细胞倍增、EdU掺入实验、平板克隆、非锚着依赖性生长实验（软琼脂平板克隆）等分析CADM2基因的过表达对鼻咽癌细胞的增殖能力和克隆形成能力的影响，，进一步通过裸鼠体内成瘤实验验证CADM2对鼻咽癌细胞的体内成瘤能力的影响。为便于检测临床组织标本中CADM2的表达，成功制备了抗CADM2的特异性鼠单克隆抗体。采用流式细胞术检测CADM2对鼻咽癌细胞周期的影响，通过Western blot和细胞免疫荧光等实验检测相关分子的表达。构建CADM2的多个结构缺失体，明确其发挥作用的相关结构域。最后通过免疫组化方法检测CADM2与细胞周期相关蛋白p-Akt、p27KIP1和p21WAF1/CIP1在鼻咽癌组织中的表达情况，分析其表达相关性。通过本课题的研究，我们发现CADM2在多种鼻咽癌细胞系中表达下调。在鼻咽癌细胞HONE1和HNE1中，发现过表达CADM2可延长鼻咽癌细胞的倍增时间、抑制细胞增殖；进一步研究发现CADM2可抑制鼻咽癌细胞的克隆形成、非锚着依赖性生长及裸鼠体内成瘤等能力。在机制研究中我们采用流式细胞术检测，发现CADM2可介导鼻咽癌细胞发生G0/G1期细胞周期阻滞。通过Western blot检测发现CADM2可抑制p-Akt的活性，上调细胞周期激酶抑制因子p27KIP1和p21WAF1/CIP1的表达，下调细胞周期进展因子CDK2、CyclinE、Skp2的表达，最终发挥细胞周期阻滞的作用。通过CADM2缺失体研究我们还发现CADM2的细胞膜定位依赖于其胞外段，从而发挥其细胞周期阻滞作用。最后通过IHC检测临床鼻咽癌组织标本，证实鼻咽癌组织中存在CADM2的表达下调，与p-Akt表达呈负相关，与p27KIP1和p21WAF1/CIP1表达及细胞核定位有关，预示着CADM2的表达在鼻咽癌发生发展中具有重要的作用。我们的结果首次阐明了CADM2在鼻咽癌中呈表达下调或缺失，参与调节PI3K/Akt/p27KIP1、p21WAF1/CIP1信号通路介导鼻咽癌细胞发生周期阻滞，从而抑制了鼻咽癌的生长，揭示了一种新的鼻咽癌发生发展的调控机制。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.63

【共引文献】