肝X受体在Behcet病和Vogt-小柳原田综合征发病中作用的研究

发布时间：2018-02-28 07:13

  本文关键词： Behcet病 Vogt-小柳原田综合征 肝X受体 Th17细胞 Th1细胞　出处：《重庆医科大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景 葡萄膜炎是一组累及葡萄膜、玻璃体、视网膜和视网膜血管的炎症，也被称为眼内炎症。由于葡萄膜炎的发病部位或累及组织不同，在临床上类型众多。如根据病因可分为感染性、外伤性、自身免疫性葡萄膜炎等，根据炎症所在位置可分为前、中间、后及全葡萄膜炎，而根据与全身性疾病的关联又可分为Fuchs综合征、Behcet病（Behcet’sdisease，BD）、Vogt-小柳原田综合征（Vogt-Koyanagi-Harada syndrome，VKH）等。Behcet病是一种以葡萄膜炎、多形性皮肤损害、口腔溃疡、生殖器溃疡等为特征的多器官、多系统受累的疾病。Vogt-小柳原田病也是一种累及全身多个系统的炎症性疾病，主要表现为脉络膜炎、脉络膜视网膜炎、视乳头炎、神经视网膜炎和肉芽肿性全葡萄膜炎，常伴有皮肤和毛发改变、听觉功能障碍、脑膜刺激征等全身性表现。该两种疾病所致的葡萄膜炎均受累组织广泛、发作频繁、治疗困难、预后差，属葡萄膜炎中处理最为棘手的类型范畴，也属我国葡萄膜炎中常见类型范畴[1]。它们的病因和发病机制均尚不完全清楚，目前有细菌感染学说、病毒感染学说、自身免疫学说等多种学说。自身免疫学说是目前广为人们所接受的一种学说，研究较多也较明确的自身免疫因素便是CD4+T细胞包括Th17、Th1、Treg细胞，及一些炎症因子包括IL-17、IFN-γ、IL-10等[2-11]。肝X受体（liver X receptor, LXR）是核受体的一种，对其功能的报道早年主要是关于脂质代谢方面[12]，近期越来越多的研究发现其在炎症及免疫调节上有重要的作用，如对CD4+T细胞及多种炎症因子有调节作用[13-15]。肝X受体活化的激动剂有内源性氧化胆固醇衍生物包括22（R）-羟固醇、24（S）-羟固醇、27-羟固醇等，和合成激动剂如T0901317、GW3965[16-20]。 因此我们进行以下实验：1.肝X受体在Behcet病患者中表达水平的研究；2.肝X受体在Vogt-小柳原田综合征患者中表达水平的研究；3. GW3965对CD4+T细胞功能的影响及其机制的研究。从而研究肝X受体会不会是引起Behcet病或Vogt-小柳原田病发病的重要因素，为这类难治、易复发的棘手疾病的治疗提供新的方向和思路。 第一部分肝X受体在Behcet病患者中表达水平的研究 目的： 研究肝X受体在Behcet病患者中的表达水平及其与疾病活动性的相关性。 方法： 将从正常人和Behcet病患者（包括疾病活动程度为活动期和静止期的患者）静脉新鲜抽取的外周血进行密度梯度离心，以分离外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）。提取PBMCs的总RNA并反转录成cDNA，用实时荧光定量PCR（Polymerase chainreaction）（RT-qPCR）的方法检测PBMCs中LXR的表达。对分离出的PBMCs使用人CD4+T细胞磁珠进行细胞分选，收集CD4+T细胞。用流式细胞技术检测正常人及病人CD4+T细胞中LXR的表达。 结果： 1.活动期Behcet病患者LXRβ在PBMCs中mRNA水平的表达及在纯化的CD4+T细胞中蛋白水平的表达均显著低于正常人。 2.静止期Behcet病患者LXRβ在PBMCs中mRNA水平的表达及在纯化的CD4+T细胞中蛋白水平的表达均与正常人无明显差异。 3. Behcet病患者（包括疾病活动程度为活动期和静止期的患者）LXRα在PBMCs中mRNA水平的表达及在纯化的CD4+T细胞中蛋白水平的表达均与正常人无明显差异。 结论： 我们的研究表明：Behcet病葡萄膜炎患者PBMCs中LXRβ的mRNA的表达低于正常对照，纯化的CD4+T细胞中LXRβ的蛋白的表达亦低于正常对照。说明与正常人相比，LXRβ的表达在BD病人中存在差异，提示与疾病存在相关性。另一亚型LXRα在PBMCs与CD4+T细胞水平均无改变。LXR的表达只在眼部炎症活动期的葡萄膜炎患者中降低，而在静止期则不然，表明其与该病的疾病发展存在某种关联。 第二部分肝X受体在Vogt-小柳原田综合征患者中表达水平的研究 目的： 研究肝X受体在Vogt-小柳原田综合征患者中的表达水平及其与疾病活动性的相关性。 方法： 将从正常人和Vogt-小柳原田综合征患者（包括疾病活动程度为活动期和静止期的患者）静脉新鲜抽取的外周血进行密度梯度离心，以分离PBMCs。用人CD4+T细胞磁珠进行细胞分选，收集CD4+T细胞。用RT-PCR和流式细胞技术检测LXR的表达。结果： 1.活动期Vogt-小柳原田综合征患者LXRβ在PBMCs中mRNA水平的表达显著低于正常人，静止期患者的表达则无明显差异。 2.活动期和静止期的Vogt-小柳原田综合征患者LXRβ在纯化的CD4+T细胞中蛋白水平的表达均与正常人无显著差异。 3. Vogt-小柳原田综合征患者（包括疾病活动程度为活动期和静止期的患者）LXRα在PBMCs中mRNA水平的表达及在纯化的CD4+T细胞中蛋白水平的表达均与正常人无明显差异。 结论： 第一部分和第二部分的结果表明：Behcet病和Vogt-小柳原田综合征患者PBMCs中LXRβ的mRNA的表达均低于正常对照，提示与疾病存在相关性。Behcet病患者中纯化的CD4+T细胞中LXRβ蛋白的表达亦低于正常对照，而Vogt-小柳原田综合征患者则与正常无差异，分析可能是PBMCs中LXRβ的低表达主要不存在于CD4+T细胞中而是PBMC中的其他种类细胞。 第三部分GW3965对CD4+T细胞功能的影响及其机制的研究 目的： 肝X受体在免疫调节中的作用尚不完全清楚。本部分研究探讨LXR对CD4+T细胞的作用及其可能的机制，从而明确LXR在BD和VKH疾病发病中的作用。 方法： 将从正常人和患者（包括活动期Behcet病和活动期Vogt-小柳原田综合征患者）静脉新鲜抽取的外周血进行密度梯度离心，以分离PBMCs。用人CD4+T细胞磁珠进行细胞分选，收集CD4+T细胞。用流式细胞技术和ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，，酶联免疫吸附试验）的方法检测LXR对CD4+T细胞功能的影响。用RT-PCR和流式细胞技术研究LXR激动剂GW3965对CD4+T细胞作用的机制。 结果： 1. GW3965抑制CD4+T细胞对IL-17、IFN-γ的分泌，对IL-10的产生无影响。 2. GW3965降低IL-17+、IFN-γ+和IL-17IFN-γ双阳Th细胞占CD4+T细胞的百分比，对Treg细胞的百分比无影响。 3. GW3965抑制转录因子RORC和T-bet在mRNA水平的表达。 4. GW3965抑制CD4+T细胞的增殖，对CD4+T细胞的凋亡无明显影响。 5.在刺激30min时，GW3965显著地降低CD4+T细胞中Nfκ（bNuclearFactor κB，核因子κB） p65(pS529)的磷酸化水平。 6.肝X受体的活化伴有载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）在mRNA水平表达的上调。 结论： 结果表明，GW3965可能通过影响转录因子的表达、Nfκb炎症信号通路等机制发挥对CD4+T细胞功能的影响，包括各类效应细胞的百分比、细胞因子的分泌、增殖、凋亡等。提示LXR的活化可通过抑制Th1和Th17细胞的效应来发挥对异常免疫反应进行调节的作用。
[Abstract]:background
Uveitis is a group of uveal involvement, vitreous body, retina and retinal vascular inflammation, also known as intraocular inflammation. Due to the different incidence of uveitis or involvement in clinical tissue, many types. Such as according to the etiology can be divided into traumatic, infectious, autoimmune uveitis, according to lesion location can be as before, the middle, and panuveitis, according to associated with systemic diseases can be divided into Fuchs syndrome, Behcet disease (Behcet sdisease, BD), Vogt- Liu Yuantian syndrome (Vogt-Koyanagi-Harada syndrome, VKH.Behcet) is a kind of disease with uveitis, pleomorphic skin lesions, oral ulcer multiple organ, genital ulcers and other characteristics, inflammatory disease multisystem disease of.Vogt- Koyanagi Harada disease is a multisystemic, mainly for choroiditis, chorioretinitis, Papillitis, neuroretinitis and granulomatous panuveitis, often accompanied by skin and hair changes, auditory dysfunction, systemic symptoms and meningeal irritation. The two kinds of diseases caused by uveitis were involved in organization wide, frequent attacks, treatment difficulties, poor prognosis, is in the category of types of uveitis is tricky, too is our common etiology and pathogenesis of uveitis with different types of [1]. they are still not completely clear, at present there is a bacterial infection theory, virus infection theory, autoimmune theory and other theories. The immunity theory is a widely accepted theory, autoimmune factors have more clear and research CD4+T cells including Th17, Th1, Treg cells and some inflammatory factors including IL-17, IFN- gamma, IL-10 [2-11]. (liver X receptor liver X receptor, LXR) is a nuclear receptor, on its function Early reports mainly on lipid metabolism of [12], more and more recent researches found in inflammation and immunity plays an important role in regulation, such as regulation of [13-15]. activation of liver X receptor agonists have endogenous oxidation of cholesterol derivatives including 22 on CD4+T cells and inflammatory factor (R) - hydroxy steroid, 24 (S) - hydroxy steroid, 27- hydroxyl steroids, and synthetic agonists such as T0901317, GW3965[16-20].
Therefore, we carried out the following experiments: the expression level of liver X receptor in 1. patients with Behcet disease; 2. liver X receptors in the Vogt- Liu Yuantian syndrome study on the expression level of patients in the study; 3. GW3965 effect on CD4+T cell function and its mechanism. To study the liver X receptor may be an important factor in causing Behcet disease or Vogt- Vogt Koyanagi Harada disease, such as refractory, provide new direction and ideas for easy difficult disease recurrence.
Study on the expression level of liver X receptor in patients with Behcet disease in the first part
Objective:
To study the expression level of liver X receptor in patients with Behcet disease and its correlation with the activity of disease.
Method锛

本文编号：1546294