人脐带间充质干细胞跨越分化及挽救感光细胞凋亡的探索研究

发布时间：2018-03-28 13:31

  本文选题：脐带间充质干细胞　切入点：N-甲基-N-亚硝基脲　出处：《武汉大学》2011年博士论文

【摘要】：研究背景视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)是临床上一类广为人知的疾病,1857年由德国科学家Franz Donders发现并命名。其临床特征是早期夜盲、双侧、进展性、非炎症性视网膜色素的变性。视杆视锥细胞丢失以后,视网膜血管周围的色素沉积相继发生。因此,“视网膜炎”这个词其实是个误称,因为视网膜的炎症并没有在疾病的进程中扮演重要作用。RP是一种异质性遗传性视网膜疾病,在视杆细胞变性的过程中,有160多种蛋白质基因密码发生了变异。典型的眼底图片呈现出视网膜内色素沉积,特别是视网膜血管周围视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)迁移和沉淀造成的骨细胞样色素沉积。到目前为止,尚没有有效的治疗方法。 间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是具有自我更新和多向分化潜能的一类成体干细胞。来源广泛,具有支持造血和多向分化的功能；最近,有研究报道从脐带静脉和脐带间质(Wharton胶)中成功地分离获得并建立了稳定的间充质干细胞培养体系。研究发现,人脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)具有跨系统、跨胚层分化的潜能,在不同诱导剂作用下,可分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞及神经元等多种中胚层、外胚层来源的细胞。Raymond将脐带、胎盘、骨髓来源的MSCs以及皮肤成纤维细胞移植到RCS (Royal college of surgeons,RCS)鼠视网膜下腔后,对保留感光细胞的完整性及视功能的有效性进行了比较。研究发现,移植细胞能与宿主视网膜整合,hUC-MSCs和骨髓MSCs都能极大地减轻视功能损害的程度,但iUC-MSCs能大面积的挽救感光细胞,而骨髓MSCs只能在局部发挥作用。hUC-MSCs被证实能群体倍增并无染色体组核型的改变,为视网膜退行性变如RP提供了一种有效的细胞来源。 目前,国内外还没有关于脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, hUC-MSCs)在体内外分化为感光细胞和在治疗感光细胞变性疾病方面的报道。因此hUC-MSCs能否诱导转化为神经元样细胞并修复视网膜损伤,非常值得我们去探索研究。 目的探索体外诱导hUC-MSCs向神经元样细胞分化的可行性,观察不同浓度全反式视黄酸(All-trans retinoic acid, ATRA)在诱导hUC-MSCs向神经元分化中对细胞形态、增殖和凋亡的作用并筛选其最适浓度；建立感光细胞缺失模型,探讨获得的hUC-MSCs移植后在大鼠视网膜内存活、分布和分化情况以及rhodopsin和recoverin的表达,为hUC-MSCs在视网膜退行性变领域的临床应用提供理论依据和实验基础。 方法取足月妊娠剖宫产新生儿的脐带,利用酶消化法和贴壁法获得原代细胞,传至第三代备用。取生长良好的第3代脐带MSC接种于24孔培养板,细胞贴壁后培养基更换为含ATRA的DMEM/F-12培养液。ATRA终浓度分别为0μmol/L(对照组,A组)、0.25μmol/L(B组)、0.5μmol/L(C组)、1.0μmol/L(D组)、2.0μmol/L(E组)、4.0μmol/L(F组),诱导后1 h、24 h观察细胞形态,并应用MTT法监测ATRA的细胞毒性。另取对照组和经各浓度ATRA诱导24 h后的细胞应用AnnexinV/PI联合流式细胞仪检测凋亡细胞百分率和双标染色后的细胞着色情况,综合上述指标确定ATRA诱导hUC-MSCs向神经元样细胞分化的最适浓度。此外,为了进一步研究hUC-MSCs的治疗潜能,我们将其移植到MNU诱导的感光细胞缺失SD (Sprague-Dawley)大鼠玻璃体腔,观察其对受损视网膜的修复情况。建模12h后,将hUC-MSCs 3～5μl移植到玻璃体腔,移植后3d和7d,通过病理组织切片测量视网膜全层及外核层厚度,TUNEL法检测凋亡细胞形态和百分比,透射电镜观察其超微结构变化,荧光免疫组化和蛋白免疫印迹观察rhodopsin和recoverin在视网膜内的表达情况。 结果 1. ATRA (0.25μmol/L、0.5μmol/L)对MSC形态、细胞增殖、细胞凋亡均无明显影响(t=0.72,1.32：P0.05)；高浓度(4.0μmol/L)加入后即刻可见部分细胞浮起,24 h后无贴壁细胞；≥1.0μmol/L ATRA诱导24 h后能极显著抑制细胞增殖(t=8.8,18.9,22.1；P0.01),且随ATRA浓度增加,抑制作用越明显。诱导24 h后,2.0μmol/L组细胞回缩较1h更明显,大部分细胞由长梭形回缩至类圆形,细胞质内出现粗大颗粒,部分细胞漂浮；1.0μmol/L组中仅有少数细胞有形态改变；Annexin V/PI联合FCM检测显示≥1.0μmol/L组细胞凋亡率与对照组间差异有统计学意义(t=9.88,19.95,31.61；P0.01)。 2. 60mg/kg MNU可选择性的诱导感光细胞缺失,MNU注射12h后,外核层(outer nuclear layer, ONL)和外节层(outer segment, OS)细胞间隙扩张呈空泡样。MNU注射1d后,感光细胞核固缩、破裂,ONL和OS层厚度轻微变薄,电镜下可观察到凋亡小体,周围的细胞出现空泡。这种变化在MNU注射7d后十分明显。但整个过程中,内核层(inner nuclear layer, INL)及节细胞层(ganglionic layer)的厚度,细胞形态数量没有发生明显改变。 3. hUC-MSCs移植后能延缓感光细胞的变性,移植细胞在SD大鼠视网膜内存活细胞数显著多于正常对照组大鼠视网膜,大部分细胞迁移至宿主视网膜外核层。移植后视网膜内recoverin和(?)rhodopsin的mRNA表达上调,在移植3d后差异有统计学意义。 结论 1.建立了高纯度、生物学特性良好的hUC-MSCs培养体系,扩展了hUC-MSCs在研科技处研究中的应用范围。0.5μmol/L ATRA是诱导脐带MSC向神经元样细胞转化的最佳剂量,≥1.0μmol/L能明显抑制MSC的增殖,增加细胞凋亡率并诱导细胞发生明显损伤。 2.一次性腹腔注射60mg/kg MNU可选择性导致感光细胞凋亡,并持续作用7d。MNU是一种广泛分布于环境中的强烷化剂,注射后大鼠感光细胞核上可见甲基化DNA嵌合物形成。因此,MNU是有效诱导视网膜变性的一个不错选择。 3. hUC-MSCs通过上调recoverin和(?)rhodopsin的mRNA表达来挽救MNU诱导的感光细胞凋亡。这提示我们,hUC-MSCs在促进损伤视网膜恢复的过程中发挥了重要作用,为未来MSCs用于临床治疗、使患者尽可能短时间内获得有效治疗及重建视功能提供了一种新的思考方向。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R774.1

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本文编号：1676532