Evi1通过上调miR-33抑制p53表达进而促进鼻咽癌细胞增殖

发布时间：2018-03-30 07:08

  本文选题：Evi1　切入点：miR-33　出处：《南方医科大学》2014年博士论文

【摘要】：研究背景和目的:鼻咽癌是我国南方部分省份最为常见的肿瘤之一,其发病率约为每10万人25～50例,是西方国家的50-100倍。先前的研究表明鼻咽癌的发生与遗传因素、EBV感染以及环境因素相关,有较为显著的家族聚集倾向性。患者基因组多存在不稳定性,易受各种环境因素的影响。EB病毒研究显示,在鼻咽癌患者的血清中,抗EB病毒抗体的种类和含量均高于一般人。可见,EB病毒与鼻咽癌的发生发展有着极其密切的关系。Evi1(Ecotropic viral integration site 1)基因是作为逆病毒的整合位点,在患髓细胞样白血病的老鼠中被发现和鉴定,逆病毒的整合使Evi1活化从而导致髓细胞样白血病的发生[1]。在人类,由于染色体t(3;21)(q26;q22)的移位或inv[2](q21q26)的倒位所致Evi1异常表达被认为与慢性髓细胞样白血病(CML)、急性髓细胞样白血病(AML)的发生相关,Evi1的持续高表达也被公认为AML的不良预后指标[3]。此外在卵巢癌[3]、结肠癌[4]和肺癌[5]等实体癌中也发现Evi1高表达。这些证据表明Evi1在肿瘤的起始和进展中起到极为重要的作用。Evi1的肿瘤促进作用是通过抑制转化生长因子β(TGF-β)的信号转导来实现,Evi1直接与TGF-β的效应分子Smad3相结合而阻断TGF-β信号的传递[6,7],或者通过与CtBP(C末端结合蛋白)相结合来抑制Smad3的功能[8]。Evi1通过两段5氨基酸序列(PFDLD......PLDLS)与CtBP结合,CtBP然后把Smad3从一个对TGF-β反应的转录活化子转换成一个转录抑制子[8,9]。EBNA3A是EBV对细胞转化所必需的五个基因之一[10,11],也是通过与CtBP相结合来促进细胞转化[12]。值得指出的是,EBNA3A是通过与Evi1五氨基酸序列类似的位点而与CtBP结合。这一现象提示,Evi1可能在功能上与EBNA3A重叠,并与鼻咽癌的发病有关。在前期实验中,我们采用微阵列比较基因组技术,发现位于3q26区的瘤基因Evi1和PKC(?)在鼻咽癌中共扩增。随之发现Evi1在大多数鼻咽癌细胞系和原发性鼻咽癌组织中均有较强表达。采用慢病毒shEvi1感染Evi1高表达的鼻咽癌细胞,沉默Evi1蛋白,导致细胞体外增殖显著减缓,裸鼠体内致瘤性显著降低。TP53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因,约有50%以上的肿瘤患者被发现有TP53基因突变,约有70%-80%的肺癌患者发现有TP53基因突变,而且TP53基因突变在肿瘤发生中是早期事件,可应用于肿瘤的早期诊断[13]。TP53基因位于人染色体17q13.1区带,编码的野生型p53蛋白包含N-末端的转录激活结构域、DNA结合结构域、四聚体化结构域和C-末端调节域[14]。p73、p51、p63等基因由于在结构上与TP53基因具有同源性,因而被归为TP53基因家族[15]。TP53基因与其上、下游功能相关基因组成了一个复杂的基因网络,是联系不同遗传应急和细胞应答的中间环节。离子辐射、化疗药物及异常的细胞生长信号均能刺激TP53基因表达[16]。p53表达升高后,可通过p53-MDM2环路对p53表达水平进行精确调节。p53可以调控下游多种基因表达,其功能主要表现在阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、维持基因组稳定性和抑制肿瘤血管生成四个方面[17,18]。microRNA是一种调节性的非编码小分子RNA,其在生命活动中起着重要的作用。microRNA 一般作用于靶标分子mRNA的非编码区,通过不完全互补配对的方式抑制靶标mRNA的翻译,从而对靶标基因在转录后水平进行调控[19]。研究发现,miR-33与多种肿瘤发生有关,miR-33能特异性结合于p53 mRNA的3'-UTR区,抑制p53表达,从而促进细胞增殖,抑制细胞凋亡[20]。在本研究中我们采用一系列分子生物学及细胞生物学技术,首次证明了 Evi1通过miR-33下调p53蛋白表达水平,影响其下游信号通路,进而影响鼻咽癌细胞的增殖、凋亡以及致瘤性。研究内容及方法:一、Evi1通过miR-33对p53进行调节(一)Evi1基因对p53表达的抑制作用1.采用免疫组化检测Evi1和p53在鼻咽癌组织中表达的相关性。2.采用Westen Blot方法,检测鼻咽癌细胞株SUNE1、CNE1、CNE2、HONE1、6-10B、5-8F以及永生化鼻咽上皮细胞NP69中Evi1和p53的表达水平。3.合成siEvi1,转染HONE1细胞,沉默Evi1。4.构建pWPI-Evi1慢病毒过表达载体,包装慢病毒感染鼻咽癌细胞6-10B,过表达Evi1。5.采用Westen Blot方法,检测在HONE1中沉默Evi1和在6-10B中过表达Evi1后,p53的表达水平。6.采用细胞免疫荧光技术,检测Evi1和p53在HONE1和NP69中的表达水平和定位以及在沉默Evi1的HONE1细胞中的表达水平和定位。(二)Evi1对p53的调节作用1.采用Westen Blot方法,分别在HONE1中沉默Evi1和在6-10B中过表达Evi1,检测p53表达水平的变化。2.采用细胞免疫荧光技术,检测在HONE1细胞中沉默Evi1后p53的表达水平和定位。(三)miR-33对p53的调节作用分别在HONE1和6-10B细胞中过表达和抑制miR-33,通过western blot检测p53表达水平的变化。(四)Evi1对miR-33的调节作用1.分别在HONE1中沉默Evi1和在6-10B细胞中过表达Evi1,采用RT-PCR技术,检测miR-33的变化情况。2.构建pGL4.51-miR-33promotor荧光素酶报告载体,与pcDNA-Evi1表达载体共转染293T细胞,检测Evi1基因对miR-33 promotor的调控作用。3.构建PGL4.51-miR-33 promotor点突变荧光素酶报告载体,明确miR-33 promotor区的Evi1调节位点。(五)Evi1通过miR-33对TP53基因表达的调控作用1.采用Westen Blot方法,分别在HONE1细胞中沉默Evi1的同时上调miR-33和在6-10B细胞中过表达Evi 1的同时抑制miR-33,检测p53表达水平的变化。2.采用免疫荧光技术,检测p53在沉默Evi1的HONE1细胞和沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1中的表达情况。二、在鼻咽癌细胞中Evi1通过miR-33调节p53信号通路,进而调节鼻咽癌细胞的增殖和凋亡。(一)Evi1对鼻咽癌细胞增殖的调节作用1.以siEvi1序列为基础构建shEvi1,稳定转染HONE1和6-10B细胞,沉默Evi1。2.采用MTT方法,检测沉默Evi1的HONE1细胞和沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞以及过表达Evi1的6-10B细胞和过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞的6天生长曲线。3.采用EdU方法,检测沉默Evi1的HOE1细胞和沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞以及过表达Evi1的6-10B细胞和过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞的EdU的吸收水平。4.采用平板克隆实验,检测沉默Evi1的HONE1细胞和沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞以及过表达Evi1的6-10B细胞和过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞的平板克隆形成率及形成克隆大小。(二)Evi1对鼻咽癌细胞周期调控蛋白的调节作用采用western blot方法,检测在沉默Evi1的HONE1细胞和沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞以及过表达Evi1的6-10B细胞和过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞中,p21和MDM2的表达水平。(三)Evi1对鼻咽癌细胞凋亡的调节作用1.采用western blot方法,检测在沉默Evi1的HONE1细胞和沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞以及过表达Evi1的6-10B细胞和过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞中,Bax和Survivin的表达水平。2.采用流式细胞仪凋亡检测方法,检测沉默Evi1的HONE1细胞和沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞以及过表达Evi1的6-10B细胞和过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞的凋亡比例。(四)采用western blot方法,检测Evi1对由化疗药物(阿霉素)诱导的p53蛋白水平上调的拮抗作用。(五)采用裸鼠体内成瘤实验,检测沉默Evi1的HONE1细胞的体内成瘤能力。对瘤体做western blot检测,再次检验Evi1和p53的表达水平。三、Evi1的癌细胞转化作用1.用pWPI-Evi1感染小鼠成纤维细胞NIH3T3和永生化鼻咽上皮细胞NP69,稳定过表达Evi1。2.采用转化灶形成实验,检测过表达Evi1的NIH3T3细胞和NP69细胞形成转化灶的能力。3.采用软琼脂克隆实验,检测过表达Evi1的NIH3T3细胞和NP69细胞在软琼脂中形成克隆的能力。4.采用裸鼠体内成瘤实验,检测过表达Evi1的NIH3T3细胞和NP69细胞的体内成瘤能力。四、统计学方法采用统计软件SPSS 13.0对实验结果进行统计学处理和分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示。RT-PCR实验采用单样本t检验,荧光素酶报告实验采用单因素方差分析(One-way ANOVA),方差分析显著时,分别采用Bonferroni和Dunnett法进行多个处理组相互比较以及多个处理组和一个对照组的多重比较。EdU实验和平板克隆实验采用单因素方差分析,方差分析显著时,采用Bonferroni法进行多重比较。P0.05被认为有统计学差异。结果:一、Evi1通过miR-33对p53进行调节(一)Evi1对p53表达的抑制作用1.采用免疫组化检测Evi1和p53在鼻咽癌组织中表达的相关性。免疫组化检测鼻咽标本显示,在50例鼻咽癌标本中,有35例呈Evi1高表达,其中29例呈p53表达阴性,6例呈p53表达阳性;15例Evi1低表达的标本中10例呈p53表达阳性,5例呈p53表达阴性。2.采用Westen blot方法检测Evi1在鼻咽癌细胞株及永生化鼻咽上皮细胞NP69中的表达水平。结果显示Evi1在鼻咽癌细胞株SUNE1,CNE1,HONE1,5-8F中呈高表达,在CNE2、6-10B细胞和永生化鼻咽上皮细胞NP69中呈低表达;p53在NP69中显著高表达,在鼻咽癌细胞5-8F中呈高表达,6-10B中呈中高表达,在CNE1,CNE2,HONE1,SUNE1 中呈中低表达。3.在HONE1中沉默Evi1和在6-10B中过表达Evi1后,Western blot结果显示,沉默Evi1使p53在HONE1细胞中表达升高;过表达Evi1则使p53在6-10B细胞中表达降低。4.免疫荧光结果显示,Evi1在HONE1中高表达,在NP69中低表达,定位于细胞核;p53在HONE1中低表达,在NP69中高表达,亦定位于细胞核。在沉默Evi1的HONE1细胞中,p53表达增强。p53在HONE1的两个处理组中均主要呈核表达。(二)Evi1对p53的调节作用1.采用Westen Blot方法,分别在HONE1中沉默Evi1和在6-10B中过表达Evi1,检测p53表达水平的变化。结果显示,在沉默Evi1的HONE1细胞中,p53表达升高;在过表达Evi1的6-10B细胞中,p53表达降低。2.采用细胞免疫荧光技术,检测在HONE1细胞中沉默Evi1后p53的表达水平和定位。结果显示,沉默Evi1后,p53在HONE1细胞中的表达水平显著升高。(三)miR-33对p53表达的抑制作用在HONE1和6-10B细胞中分别过表达和抑制miR-33后,通过western blot检测p53的表达水平。结果显示,在HONE1细胞中,过表达miR-33,p53表达略降低,抑制miR-33,p53表达升高;在6-10B细胞中过表达miR-33,p53表达降低,抑制miR-33,p53表达升高。(四)Evi1对miR-33的促进作用1.采用RT-PCR技术,分别在HONE1中沉默Evi1以及在6-10B中过表达Evi1后,检测miR-33的变化情况。结果显示,miR-33在沉默Evi1的HONE1细胞中扩增量减低(tHONE1=-43.862,PHONEI=0.001);在过表达Evi1的6-10B细胞中,扩增量升高(t6-1OB=1 72.730,P6-1OB=0.000)。2.构建两组pGL4.51-miR-33 promotor荧光素酶报告载体(pGL4.51-miR-33 promotor upstream,pGL4.51-miR-33 promotor downstream),分另与pcDNA3-Evi1表达载体共转染293T细胞,检测Evi1对miR-33 promotor的调节作用。结果显示,与pcDNA3-Evi 1共转染的两组293T细胞荧光素酶活性均比与pcDNA3共转染的对照组有不同程度升高(tup=-18.464,Pup=0.003;tdown=-7.557,Pdown=0.017)。3.构建五组pGL4.51-miR-33 promotor点突变荧光素酶报告载体,明确miR-33 promotor区的Evi1调节位点。结果显示,分别点突变可能受Evi1调节的五个miR-33 promotor位点,其中上游-2378和下游+183两处调节位点突变后,荧光素酶活性较未突变的对照组显著降低(Fup=220.621,Pup=0.000;Fdown=98.451,Pdowen=0.000)。(五)Evi1通过上调miR-33抑制p53的表达1.WestenBlot结果显示,在沉默Evi1的HONE1细胞中,p53表达升高,在沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞中,p53表达的升高趋势被部分抑制,但较对照组仍略有升高,在过表达Evi1的6-10B细胞中,p53表达降低,在过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞中,p53表达的降低趋势被部分回调,但较对照组仍略有降低。2.免疫荧光结果显示,在沉默Evi1的HONE1细胞中,p53表达升高。在沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞中,p53表达无显著升高。二、在鼻咽癌细胞中Evi1通过miR-33调节p53信号通路,进而调节细胞的增殖、周期和凋亡。本部分选取鼻咽癌细胞HONE1和6-10B作为实验对象。(一)Evi1对鼻咽癌细胞增殖的调节作用1.MTT实验结果显示,沉默Evi1的HONE1细胞生长速度较对照组显著减缓,沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞生长速度较单独沉默Evi1组加快,但较对照组仍减缓;过表达Evi1的6-10B细胞生长速度较对照组显著加快,过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞生长速度较单独过表达Evi1组减缓,但较对照组仍加快。2.EdU吸收实验结果显示,沉默Evi1的HONE1细胞EdU吸收水平较对照组显著降低,沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞EdU吸收水平较单独沉默Evi1组增高,但仍较对照组降低(F=26.558,P=0.001);过表达Evi1的6-10B细胞EdU吸收水平较对照组显著增高,过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞EdU吸收水平较单独过表达Evi1组降低,但仍较对照组增高(F=33.134,P=0.001)。3.平板克隆实验结果显示,沉默Evi1的HONE1细胞形成克隆速度,克隆大小均较对照组显著减低,沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞形成克隆速度,克隆大小均较单独沉默Evi1组增高,但仍较对照组减低(F=180.399,P=0.000);过表达Evi1的6-10B细胞形成克隆速度,克隆大小较对照组显著增高,过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞形成克隆速度,克隆大小较单独过表达Evi1组减低,但仍较对照组增高(F=244.169,P=0.000)。(二)Evi1对鼻咽癌细胞周期调控蛋白的调节作用p21和MDM2是调节细胞周期的重要因子,Western blot结果显示,它们在两种细胞各组中的表达水平与p53基本一致。在沉默Evi1的HONE1细胞中,表达升高,在沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞中,表达较单独沉默Evi1组降低,但仍较对照组略增加;在过表达Evi1的6-10B细胞中,表达水平降低,在过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞中,表达水平较单独过表达Evi1组升高,但仍较对照组略降低。(三)Evi1对鼻咽癌细胞凋亡的调节作用1.Western b1ot结果显示,Bax的表达水平在两种细胞各组中的变化趋势与p53基本一致。而Survivin的表达水平与p53相反,在沉默Evi1的HONE1细胞中,表达水平降低,在沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞中,表达水平较单独沉默Evi1组升高,但仍较对照组略降低;在过表达Evi1的6-10B细胞中,表达水平升高,在过表达Evi1的同时抑制miR-33的6-10B细胞中,表达水平较单独过表达Evi1组降低,但仍较对照组略升高。2.流式细胞仪凋亡检测结果显示,沉默Evi1的HONE1细胞凋亡细胞比例较对照组增加,沉默Evi1的同时上调miR-33的HONE1细胞早期凋亡细胞较单独沉默Evi1的HONE1细胞组降低,较对照组略增加。过表达Evi1的6-10B细胞凋亡细胞比例较对照组减少,过表达Evi1的同时下调miR-33的6-10B细胞凋亡细胞较单独沉默Evi1的HONE1细胞组增加,较对照组略减低。(四)采用western b1ot方法,检测Evi1对由阿霉素(Doxorubicin)诱导的p53蛋白水平上调的拮抗作用。结果显示,阿霉素可诱导p53表达,并呈时间依赖性,该作用可被Evi1部分拮抗。(五)采用裸鼠体内成瘤实验,检测沉默Evi1对鼻咽癌细胞体内成瘤性的影响。结果显示,沉默Evi1的HONE1细胞于接种后第10天开始形成肿瘤,对照组于接种后第6日开始成瘤。至第四周末观察截止时,沉默Evi1的HONE1细胞所成肿瘤体积显著小于对照组。Western blot结果显示,在沉默Evi1的HONE1细胞形成的肿瘤组织中,Evi1仍较对照组降低,p53仍较对照组增高。三、Evi1的癌细胞转化作用1.采用转化灶形成实验,检测过表达Evi1的NIH3T3和NP69细胞形成转化灶的能力。在NIH3T3细胞中过表达Evi1可在三周内平均形成1-3个转化灶/孔(24孔板),对照组无转化灶形成。在NP69中过表达Evi1的及其对照组细胞在三周内均无转化灶形成。2.采用软琼脂克隆形成实验,检测过表达Evi1的NIH3T3和NP69细胞在软琼脂中形成克隆的能力。在NIH3T3细胞中过表达Evi1在三周内形成6-8个克隆/孔(12孔板),对照组形成2-3克隆/孔,两组克隆大小无显著差异。在NP69中过表达Evi1在三周内形成1-2个克隆/孔(12孔板),对照组无克隆形成。3.采用裸鼠体内成瘤实验,检测过表达Evi1的NIH3T3的体内成瘤能力。结果显示,至第八周末停止观察时,NIH3T3细胞的处理组和对照组均无肿瘤形成。结论1.Evi1通过上调miR-33抑制p53表达。2.沉默Evi1在鼻咽癌细胞中部分通过促进p53信号通路抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。3.Evi1可部分拮抗由DNA损伤药物诱导的p53蛋白水平上调。本研究创新之处1.第一次证明Evi1通过miR-33对p53进行调节。2.第一次证明Evi1通过p53信号通路对鼻咽癌细胞增殖和凋亡进行调节。3.第一次证明Evi1可部分拮抗由DNA损伤药物诱导的p53蛋白水平上调。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.63

【参考文献】

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4 黄伟;孙岩;韩瑞发;;MicroRNA与癌症的研究进展[J];天津医药;2009年03期

5 成秀梅;;肿瘤抑制基因p53的研究进展[J];现代诊断与治疗;2008年03期

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本文编号：1684855