RNA干扰治疗视网膜色素变性的动物实验研究

发布时间：2018-04-05 15:10

  本文选题：视网膜色素变性　切入点：RNA干扰　出处：《第二军医大学》2010年博士论文

【摘要】： 目的 1.本实验通过基因打靶技术构建携带人突变RHO基因的视网膜变性小鼠。对构建成功的不同鼠龄小鼠视网膜进行组织病理变化研究,明确其病理改变特点。 2.制备靶向RHO基因的LV-GFP-shRNA。通过显微注射器将慢病毒载体注射入小鼠视网膜下腔内。研究注射后不同时间hRHO的mRNA和蛋白表达变化；不同时间视网膜转染率和视网膜形态学变化。从而评估RNA干扰技术治疗效果,为临床应用提供实验依据。 方法 1.构建mRHOp-hRHO-SV40A-PBS质粒,进行小鼠原核受精卵注射,繁育出转基因小鼠。RT-PCR及western-blot方法鉴定转基因小鼠。 2.18只RP小鼠随机分成4组。在小鼠出生后15天、30天、60天各处死6只。5只健康小鼠进行对照。过量戊巴比妥钠腹腔注射处死小鼠后迅速完整摘取小鼠眼球,沿视神经做3mm厚度的切片。分别行HE染色、原位细胞凋亡检测和电镜超微检测。比较不同时间视网膜外核层厚度的变化、感光细胞凋亡阳性率及光感受器细胞超微结构的改变。结果采用组间T检验,spss13.0统计软件进行统计学分析。 3.利用前期实验证实体外转染基因沉默效率为79.14%的靶向hRHO的siRNA序列,构建pGCL-GFP-shRNA慢病毒穿梭质粒,并制备LV-GFP-shRNA。 4.80只15天鼠龄RP小鼠,左眼作为对照组,不做任何处理；右眼视网膜下腔注射LV-GFP-shRNA。分别在注射后15天、30天、45天、60天随机各处死20只RP小鼠。应用半定量RT-PCR及western-blot方法检测治疗后不同时间RP小鼠视网膜hRHO mRNA及蛋白表达变化。视网膜铺片观察治疗后不同时间视网膜转染率,视网膜色素细胞荧光染色的范围用0到3级评估。(0：没有发现荧光细胞；1：散在的阳性细胞；2：部分阳性细胞连在一起；3：连续的阳性细胞)。行免疫荧光染色观察视网膜RHO表达,行HE染色观察视网膜外核层厚度变化。 结果 1. mRHOp-hRHO-SV40-PBS质粒经各种酶切鉴定位置正确后鉴定测序。质粒线性化位点为NotI和Pvul,双酶切后可切成3037bp(回收)和1679bp、1043bp,回收3037bp用于显微注射。小鼠受精卵注射后成功繁育出表达hRHO突变基因的RP小鼠。 2.RP小鼠出生后15天,视网膜外核层及内核层已经可以分出层次。正常对照组视网膜外核层在各个时间点没有明显的变化(9.30±0.37),而RP小鼠出生15天外核层开始变薄(7.05±0.25),30天明显变薄(5.29±0.24),60天外核层减至单层(2.04±0.28)。TUNEL染色正常对照组为阴性,RP小鼠15天出现散在阳性颗粒,60天出现大片阳性颗粒。提示光感受器细胞出现大量坏死及凋亡。透射电镜显示：早期视网膜视杆细胞外节正常、外界膜连续,30天开始视杆细胞外节缩短,外界膜开始变细,不连续。盘膜出现空泡状改变,内节线粒体、内质网均有不同程度变性,溶解；细胞核出现核浓缩,发生凋亡。 3.成功构建靶向hRHO的pGCL-GFP-shRNA'慢病毒穿梭质粒,并制备出滴度为1.0×1010ifu/ml的LV-GFP-shRNA。 4.RP小鼠在进行右眼LV-GFP-shRNA注射后30天时RHO mRNA表达开始下降,到60天时明显下降。组内比较：在45天、60天mRNA表达水平LV-GFP-shRNA组较阴性对照组有明显下降(P0.05)。在蛋白表达水平上,LV-GFP-shRNA组在30天时较对照组表达开始下降,45天时进一步下降,60天时又趋于平稳。组内比较：在45天、60天蛋白表达水平LV-GFP-shRNA组较阴性对照组有明显下降(P0.05)。视网膜ONL层数改变LV-GFP-shRNA组较阴性对照组在15天、30天、45天均没有明显差异,到60天时出现LV-GFP-shRNA组较阴性对照组ONL层数增厚(P0.05)。 结论 1.利用转基因技术成功构建出表达hRHO突变基因的视网膜变性小鼠。为后续研究治疗提供可靠的动物模型。 2.本实验构建出的RP小鼠模型中视网膜组织病理学改变与人类RHO基因突变引起的视网膜色素变性的病理改变类似,为下一步行基因治疗疗效判定提供形态学依据。 3.成功构建靶向hRHO的pGCL-GFP-shRNA慢病毒穿梭质粒,并制备出滴度为1.0×1010ifu/ml的LV-GFP-shRNA。 4. LV-GFP-shRNA视网膜下腔注射后短期可以明显下调RHO蛋白表达。为RNA干扰技术治疗人类视网膜色素变性提供可靠的动物实验依据。
[Abstract]:Purpose



1 . In this experiment , retinal degeneration mice bearing human mutation RHO gene were constructed by gene targeting technique . The pathological changes of retinal tissues of different mouse - age mice were studied .



2 . preparing the LV - GFP - shRNA targeting the RHO gene , injecting the slow viral vector into the subretinal cavity of the mouse through a micro injector , and researching the mRNA and protein expression changes of hRHO after injection ;
The effect of RNA interference was evaluated and the experimental basis was provided for clinical application .



method



1 . Construction of mRHO - SV40A - PBS plasmid was carried out in mice , and the transgenic mice were bred by RT - PCR and western - blot .



2 . 18 RP mice were randomly divided into 4 groups . 6 . 5 healthy mice were sacrificed 15 days , 30 days and 60 days after birth .



3 . The siRNA sequence targeting hRHO with the silencing efficiency of 79.14 % in vitro was confirmed by previous experiments , and the pGCL - GFP - shRNA lentivirus shuttle plasmid was constructed and LV - GFP - shRNA was prepared .



4.80 days old RP mice , left eye as control group , do not do any treatment ;
Left - eye subretinal cavity injected with LV - GFP - shRNA . 20 RP mice were sacrificed on 15 days , 30 days , 45 days and 60 days after injection . The changes of hRHO mRNA and protein expression in the retina of RP mice after treatment were detected by semi - quantitative RT - PCR and western - blot .
1 : scattered positive cells ;
2 : part of the positive cells were linked together ;
3 : continuous positive cells ) . The retinal RHO expression was observed by immunofluorescence staining , and the thickness of the outer nucleus of the retina was observed by HE staining .



Results



1. mRHOp-hRHO-SV40-PBS璐ㄧ矑缁忓悇绉嶉叾鍒囬壌瀹氫綅缃�姝ｇ‘鍚庨壌瀹氭祴搴�.璐ㄧ矑绾挎，

本文编号：1715295