局部应用鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂1抑制小鼠同种异体角膜移植排斥的研究

发布时间：2018-04-11 17:34

本文选题：鞘氨醇-1-磷酸1 + 角膜移植　；参考：《中国人民解放军医学院》2014年博士论文

【摘要】：目的：通过手术方法建立小鼠同种异体角膜移植模型，予以局部应用鞘氨醇-1-磷酸受体调节剂1（S1P1），观察S1P1对小鼠角膜移植片免疫排斥的影响，并与临床常用的眼用免疫抑制剂地塞米松（DXM），雷帕霉素（Rapa）和环孢霉素A（CsA）进行比较，最终明确S1P1抑制小鼠角膜移植排斥反应的效果；通过检测小鼠体内及角膜植片内树突细胞相关的免疫因子水平和蛋白的表达，，探索S1P1抑制角膜植片免疫排斥的作用机制；探索局部S1P1联合用药对小鼠角膜移植术后免疫排斥的影响。方法： 1、利用经典手术方法建立以雄性C57BL/6小鼠（24只）为供体，雄性BALB/C小鼠（48只）为受体的同种异体角膜移植实验模型，每只小鼠随机选取一眼作为受体眼，分别接受雄性C57BL/6小鼠角膜植片，并随机分为六组（A、B、C、D、E和F组），每组8只，A组为不含药物的安慰剂眼液对照组，B组为0.25%S1P1混悬眼液组，C组为0.5%S1P1混悬眼液组，D组为0.1%地塞米松眼液组，E组为0.4%雷帕霉素眼液组，F组为1%环孢霉素A眼液组。各组术后分别采用局部眼表点药，每日4次（8-12-16-20点），持续给药直至角膜植片发生排斥。术后10-11天于手术显微镜下拆除小鼠角膜移植缝线，术后每日观察小鼠角膜植片变化情况，至发生角膜排斥后处死实验动物。 2、建立以雄性C57BL/6小鼠（15只）为供体，雄性BALB/C小鼠（30只）为受体的同种异体角膜移植实验模型。每只小鼠随机选取一眼作为受体眼，分别接受雄性C57BL/6小鼠角膜植片，并随机分为五组（G、H、I、J和K组），每组6只。G组为不含药物的安慰剂眼液对照组，H组为0.5%S1P1混悬眼液组，I组为0.1%地塞米松眼液组，J组为0.4%雷帕霉素组，K组为1%环孢霉素A眼液组。术后分别给予上述方案分组方案处置，术后10-11天拆除角膜缝线。并于术后14d时处死全部小鼠，取单侧颈部引流淋巴结、外周血、脾脏等行流式细胞学检测，探讨CD11c+、MHC-II+和CD86+DCs细胞的分布和聚集状态。取外周血血清行Elisa检查IL-2、IL-12、TGF-β1、IFN-γ和CTLA-4水平；每组取3只小鼠角膜，提取总RNA，行Realtime-PCR检查各组植片中IL-2、IL-12、TGF-β1、IFN-γ和CTLA-4mRNA的表达情况；每组取3只小鼠角膜分别进行常规HE染色，了解角膜排斥反应情况，行免疫组化检查了解MHC-II+DCs和CD86+DCs细胞在角膜植片中的的分布及浸润情况。3、建立以雄性C57BL/6小鼠（16只）为供体，雄性BALB/C小鼠（32只）为受体的同种异体角膜移植实验模型，小鼠随机选取一眼作为受体眼，分别接受雄性C57BL/6小鼠角膜植片，并随机分为四组（L、M、N和O组），每组8只。L组为不含药物的安慰剂眼液对照组，M组为0.1%地塞米松眼液组，N组为0.5%S1P1混悬眼液联合0.4%雷帕霉素眼液组，O组为0.5%S1P1混悬眼液联合1%环孢霉素眼液组。自手术后第一日开始，分别给予局部眼表点药，每日4次（8-12-16-20点），联合给药组两种眼药给药间隔为10分钟，持续给药至角膜发生排斥。术后10-11天拆除角膜缝线。术后每日对各组小鼠移植后角膜排斥时间进行观察并照相，记录植片情况，绘制生存曲线，至发生角膜排斥后予过量麻醉处死实验动物。结果： 1、对48只同种异体角膜移植小鼠术后角膜植片进行统计分析，空白对照组角膜植片平均存活时间为16.8±1.7天(n=8)；0.25%S1P1眼液组角膜植片平均存活时间为17.8±1.9天（p0.01, n=8）；0.5%S1P1眼液组角膜植片平均存活时间为27.6±3.3天（p0.01, n=8）；0.1%地塞米松眼液组角膜植片平均存活时间为31.9±4.3天（p0.01, n=8）；0.4%雷帕霉素眼液组角膜植片平均存活时间为25.1±4.0天（p0.01, n=8）；1%环孢霉素A组角膜植片平均存活时间为25.8±4.2天（p0.01, n=8）。 2、与空白对照组相比较，0.25%S1P1眼液组植片存活时间有所延长，但无统计学差异（P0.05）；0.5%S1P1眼液组、0.1%地塞米松眼液组、0.4%雷帕霉素眼液组、1%环孢霉素A眼液组植片存活时间明显延长，并且有显著性差异（P0.01）。与0.5%S1P1眼液组相对比，0.1%地塞米松眼液组植片存活时间明显延长，有统计学差异（P0.05）;0.4%雷帕霉素眼液组、1%环孢霉素A眼液组植片存活时间无延长，且无统计学差异（P0.05）。 3、局部应用0.5%S1P+1眼液可显著增加外周血中MHC-IICD11c+细胞比例（P0.01），显著降低颈部淋巴结中MHC-II+CD11c+细胞和MHC-II+CD86+细胞的比例（P0.05）。 4、局部应用0.1%地塞米松眼液可显著增加外周血中MHC-II+CD11c+细胞比例（P0.01）和显著降低脾脏中MHC-II+CD11c+细胞比例（P0.05），显著降低颈部淋巴结中MHC-II+CD11c+细胞和MHC-II+CD86+细胞的比例（P0.05和P0.01）。 5、局部应用0.4%雷帕霉素眼液可显著降低外周血中和颈部淋巴结中MHC-II+CD11c+细胞比例（P0.05），显著增加外周血中MHC-II+CD86+细胞的比例（P0.01），显著降低颈部淋巴结中MHC-II+CD86+细胞的比例（P0.01），显著降低脾脏中MHC-II+CD86+细胞的比例（P0.05）。 6、局部应用1%环孢霉素A眼液可显著降低外周血中和颈部淋巴结中MHC-II+CD11c+细胞和MHC-II+CD86+细胞的比例（P0.05， P0.01；分别地），显著增加脾脏中MHC-II+CD86+细胞的比例（P0.05）。 7、外周血血Elisa检查，对比空白对照组，0.5%S1P1眼液组、0.1%地塞米松眼液组、0.4%雷帕霉素眼液组和1%环孢霉素A眼液组的IL-2、IL12、IFN-γ、TGF-β1和CTLA-4水平均无显著性差异（P0.05）。 8、各组植片中，对比空白组，1%环孢霉素A眼液组植片中IL-2mRNA和IFN-γmRNA表达量显著下降（P0.05）；0.5%S1P1眼液组植片中TGF-β1mRNA和CTLA-4mRNA表达量显著增加（P0.05），IL-12mRNA表达量显著下降（P0.05）。 9、小鼠角膜植片HE染色和免疫组化检查提示：空白对照组显著水肿增厚、大量炎性细胞浸润，植片上皮和基质内大量CD86+DCs和MHC-II+DCs细胞增值浸润；0.5%S1P1眼液组上皮轻度水肿，基质层轻度增厚，植片内分布较多炎症细胞，植片上皮内可见少许CD86+DCs和MHC-II+DCs细胞增殖浸润；0.1%地塞米松眼液组角膜植片可见上皮轻度水肿，基质层轻度水肿增厚，植片内亦可见较多炎症细胞，植片基质层内可见少许CD86+DCs和MHC-II+DCs细胞增殖浸润；0.4%雷帕霉素眼液组上皮中度水肿，基质层无明显水肿，植片内亦可见较多炎症细胞，植片上皮层和浅层基质层内可见少许CD86+DCs和MHC-II+DCs细胞增殖浸润；1%环孢霉素A眼液组角膜植片可见上皮轻度水肿，基质层无明显水肿，植片内散在分布少量炎症细胞，角膜植片上皮层内可见少许CD86+DCs和MHC-II+DCs细胞增殖浸润。 10、0.5%S1P1眼液联合用药实验中，空白对照组角膜植片平均存活时间为16.5±2.3天（n=8）；0.1%地塞米松眼液组角膜植片平均存活时间为32.7±4.0天（p0.01, n=8）；0.5%S1P1+0.4%雷帕霉素眼液组角膜植片平均存活时间为31.8±3.8天（p0.01, n=8）；0.5%S1P1+1%环孢霉素A眼液组角膜植片平均存活时间为33.1±3.9天（p0.01, n=8）。 11、0.5%S1P1眼液联合用药实验中，与空白对照组相比，0.1%地塞米松眼液组，0.5%S1P1混悬眼液联合0.4%雷帕霉素眼液组，0.5%S1P1混悬眼液联合1%环孢霉素A眼液组均可延长植片的平均存活时间，且具有显著性差异（P0.01）；三个治疗组相比，在角膜植片术后平均生存时间方面，0.5%S1P1混悬眼液联合1%环孢霉素A眼液组优于0.1%地塞米松眼液组，而0.1%地塞米松眼液组优于0.5%S1P1混悬眼液联合雷帕霉素眼液组，但是三组在统计学上无显著性差异（P0.05）。结论： 1、在同种异体小鼠角膜移植模型中，局部使用0.5%S1P1眼液，0.4%雷帕霉素眼液和1%环孢霉素A眼液均可显著延迟小鼠角膜植片的平均存活时间，但三治疗组之间无统计学差异。 2、同以上三个治疗组相比，0.1%地塞米松眼液组可以更好地延迟小鼠角膜植片的平均存活时间，并且有统计学差异。 3、0.5%S1P1眼液显著增加外周血中成熟DCs比例，减少颈部引流淋巴结中的成熟DCs的比例。0.5%S1P1眼液可以显著降低DCs的抗原提成能力。 4、0.5%S1P1眼液对外周血清中IL-2、IL-12、TGF-β1、IFN-γ和CTLA-4等细胞因子水平无影响。 5、0.5%S1P1眼液显著上调小鼠角膜植片内的TGF-β1和CTLA-4mRNA的表达量，显著下调IL-12mRNA的表达量。 6、0.5%S1P1眼液显著减少角膜植片基质层和内皮层的炎症细胞的浸润；0.5%S1P1眼液能显著减少角膜植片中成熟DCs的浸润。 7、在同种异体小鼠角膜移植术后联合用药方案中，0.5%S1P1混悬眼液联合1%环孢霉素A眼液组小鼠角膜植片平均存活时间最长，两者具有协同免疫抑制作用。 8、0.5%S1P1混悬眼液联合1%环孢霉素A眼液可以替代0.1%地塞米松眼液抗同种异体小鼠角膜移植术后排斥。
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【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R779.65

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