靶向si-EGFR对人晶状体上皮细胞增殖的影响

发布时间：2018-04-21 06:14

  本文选题：表皮生长因子受体 + 短发卡状RNA　； 参考：《天津医科大学》2011年博士论文

【摘要】：目的:设计有效抑制表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因表达的小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)序列,构建相应的真核表达载体,转染到人晶状体上皮细胞(Human lens epithelial cells,HLEs)中,研究其对HLEs细胞生物学特性的影响;同时筛选出促进HLEs细胞增长的重组表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)的最适宜浓度,进一步研究在最适宜浓度的EGF刺激下,EGFR的siRNA对HLEs细胞生长的影响,从而明确EGFR的siRNA的抑制效果,并推断出si-EGFR抑制HLEs细胞增长的分子机制。方法:1、根据siRNA设计原则,设计并体外化学合成靶向EGFR基因的特异性短发卡状 RNA(short hairpin RNA,shRNA),克隆到 pSilencer2.1-U6neo 载体中,构建si-EGFR的表达载体,同时以pSilencer2.1-U6neo空转载体为阴性对照,在脂质体介导下分别转染HLEs细胞,以免疫荧光技术定位EGFR;实时荧光定量PCR(Real time FQ-PCR)检测HLEs中EGFR的mRNA水平上表达的变化;Western-blot蛋白印迹法检测EGFR在蛋白表达上的变化;MTS法及细胞生长曲线分别检测细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞生长周期变化。2、体外传代HLEs细胞,以不同浓度(0.1、1、10ng/mL)的外源性重组EGF分别刺激HLEs,观察HLEs细胞的形态变化和生长情况,自加入重组EGF即刻起,通过MTS法连续4d测量各组细胞光密度(Optical Density,OD)490及570的值;同时连续7d计数细胞个数,绘制细胞生长曲线以检测细胞增殖活性,从而寻找能促进HLEs细胞生长的重组EGF的最适宜浓度。3、分别转染pSilencer2.1-shRNA-EGFR及pSilencer2.1-U6neo空转载体两组质粒到HLEs细胞,并在两组转染后的细胞中加入最适宜浓度的等量重组EGF,通过MTS法连续4d检测细胞OD490和OD570数值,并连续7d计数细胞个数,绘制细胞生长曲线,观察在EGF干扰下,EGFR的siRNA对HLEs细胞增殖的影响。结果:1、Western-blot蛋白印迹法与Real time PCR检测法的结果一致,转染细胞48h后,si-EGFR实验组中EGFR的mRNA表达水平是阴性对照组的0.450625倍;蛋白水平si-EGFR实验组是阴性对照组的0.1194倍,是空白对照组的0.1149倍,组间比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。这些结果表明构建的si-EGFR表达载体pSilencer2.1-shRNA-EGFR无论在分子水平还是蛋白水平均明显抑制EGFR的表达。2、流式细胞检测技术结果表明,72h之后,转染了 si-EGFR质粒的HLEs,G1期细胞占到41.6%,而未进行基因沉默的阴性对照组G1期的细胞占到29.5%;同时转染了 si-EGFR质粒的HLEs细胞,G2期占到27.5%,而阴性对照组G2期的细胞占到43.7%;转染了 si-EGFR质粒的HLEs细胞,其增殖指数为140.4%,而阴性对照组的增殖指数为239%。以上结果显示:si-EGFR影响了 HLEs细胞从G1期进入S期,从而作用于细胞周期进程。MTS法及细胞生长曲线的结果一致,证实了转染了 si-EGFR质粒的HLEs细胞自转染后24小时开始,生长活性明显降低,且随着时间推移,生长活性降低的更为明显(P＜0.01)。3、以不同浓度的重组EGF刺激HLEs细胞发现:在一定范围内,重组EGF浓度增高,细胞的增殖活性也随之增高,当重组EGF浓度为1ng/mL时,HLEs细胞的增殖活性最强,但是超过了这个范围,高浓度的EGF反而会抑制细胞生长;细胞生长曲线检测结果与MTS结果一致。4、转染了 si-EGFR质粒的HLEs细胞尽管受到了最适宜浓度重组EGF的刺激,但是细胞增殖不明显,而阴性对照组在接受了 1ng/mL重组EGF的刺激后,细胞增殖活性显著提高,MTS检测结果与细胞生长曲线一致,两组组间比较差异具有统计学意义(P0.01)。结论:1、体外化学合成的pSilencer2.1-shRNA-EGFR表达载体在分子水平及蛋白水平上均能明显降低HLEs细胞中EGFR的表达,并因而有效抑制了 HLEs细胞的增殖活性。靶向si-EGFR为预防后发性白内障提供了新的思路。2、适宜浓度的重组EGF可以刺激HLEs细胞的生长,过高浓度的重组EGF反而会抑制细胞的生长,1ng/ml的重组EGF最有利于促进HLEs细胞的生长。3.、适宜浓度的重组EGF也不能促进si-EGFR作用过的HLEs细胞的增殖,因此我们推断转染了 pSilencer2.1-shRNA-EGFR的HLEs细胞,其增殖活性的降低是通过EGF-EGFR通路的阻断得以实现的。
[Abstract]:Objective: to design a small interfering RNA (short interfering RNA, siRNA) sequence that effectively inhibits the expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) gene, and to construct a corresponding eukaryotic expression vector and transfect into the human lens epithelial cells (Human lens). At the same time, the optimum concentration of the recombinant epidermal growth factor (epidermal growth factor, EGF) to promote the growth of HLEs cells was screened, and the effect of siRNA on the growth of HLEs cells was further studied under the optimum concentration of EGF, and the inhibitory effect of EGFR siRNA was determined, and the molecular machine for inhibiting the growth of si-EGFR to inhibit the cell growth was deduced. Methods: 1, according to the design principle of siRNA, the specific short hairpin RNA (short hairpin RNA, shRNA) targeting EGFR gene was designed and synthesized in vitro, and was cloned into pSilencer2.1-U6neo vector to construct the expression vector of si-EGFR, while pSilencer2.1-U6neo empty reloading body was negative control, and transfected into HLEs thin under liposome. Cell, immunofluorescence technique was used to locate EGFR; real-time quantitative PCR (Real time FQ-PCR) was used to detect the changes in the mRNA level of EGFR in HLEs; Western-blot protein blotting was used to detect the changes of EGFR in protein expression; MTS method and cell growth curve were used to detect cell proliferation activity; flow cytometry was used to detect cell growth cycle changes.2, body The external HLEs cells were stimulated by exogenous recombinant EGF with different concentrations (0.1,1,10ng/mL). The morphological changes and growth of HLEs cells were observed. The values of the light density (Optical Density, OD) 490 and 570 of each group were measured by MTS method from the instant 4D, and the number of cells was counted by continuous 7d, and cell growth was plotted. The curve was used to detect cell proliferation activity, so as to find the most suitable concentration.3 of recombinant EGF that could promote HLEs cell growth, transfect two groups of plasmids of pSilencer2.1-shRNA-EGFR and pSilencer2.1-U6neo empty reload bodies to HLEs cells, and add the most suitable concentration of recombinant EGF in the two groups of transfected cells, and continuous 4D detection by MTS method. The number of cells OD490 and OD570, counting the number of cells in continuous 7d, plotting the cell growth curve, and observing the effect of EGFR siRNA on the proliferation of HLEs cells under the interference of EGF. Results: 1, the result of Western-blot blot and Real time PCR detection method is consistent. After transfection of cell 48h, the level of expression is negative control The protein level si-EGFR experimental group was 0.1194 times more than the negative control group and 0.1149 times the blank control group, and the difference between the groups was statistically significant (P < 0.01). These results showed that the constructed si-EGFR expression vector, pSilencer2.1-shRNA-EGFR, significantly inhibited the expression of EGFR in the level of molecular water and protein, and the expression of.2 in EGFR was obviously inhibited. Flow cytometry showed that after 72h, the transfection of si-EGFR plasmid HLEs, G1 phase cells accounted for 41.6%, while the negative control group without gene silencing accounted for 29.5% in G1 stage, HLEs cells of si-EGFR plasmids, G2 period 27.5%, and negative group G2 phase 43.7%; si-EGFR plasmid transfected. The proliferation index of HLEs cells was 140.4%, while the proliferation index of the negative control group was above 239%. showed that si-EGFR affected HLEs cells to enter S phase from G1 phase, thus the result of.MTS method and cell growth curve in cell cycle process was consistent, which confirmed that the HLEs cells transfected with si-EGFR plasmids began to grow at 24 hours after the transfection of si-EGFR plasmids. The activity decreased obviously, and the growth activity decreased more obviously over time (P < 0.01).3. The recombinant EGF stimulated HLEs cells with different concentrations. In a certain range, the concentration of the recombinant EGF increased and the proliferation activity of the cells increased. When the concentration of the recombinant EGF was 1ng/mL, the proliferation activity of HLEs cells was the strongest, but it exceeded that. In the range, high concentration of EGF could inhibit cell growth, and the results of cell growth curve were consistent with the results of MTS.4. The HLEs cells transfected with si-EGFR plasmids were stimulated by the most suitable concentration of recombinant EGF, but the cell proliferation was not obvious, while the negative control group had a significant proliferation activity after the stimulation of the 1ng/mL recombinant EGF. The results of MTS detection were in accordance with the cell growth curve, and the difference between the two groups was statistically significant (P0.01). Conclusion: 1, the pSilencer2.1-shRNA-EGFR expression vector synthesized in vitro could significantly reduce the expression of EGFR in the HLEs cells, and thus effectively inhibit the proliferation activity of HLEs cells. Targeted si-EGFR provides a new way of thinking.2 for the prevention of post cataract. The suitable concentration of recombinant EGF can stimulate the growth of HLEs cells. The high concentration of recombinant EGF will inhibit the growth of cells. The recombinant EGF of 1ng/ml is most conducive to promoting the growth of HLEs cells, and the suitable concentration of recombinant EGF can not promote HLEs fined by si-EGFR action. Cell proliferation, we concluded that the transfection of pSilencer2.1-shRNA-EGFR HLEs cells reduced the proliferation activity through EGF-EGFR pathway blocking.

【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R776.1

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本文编号：1781255