基因表达谱分析miR-431小鼠耳聋的机制及小耳畸形患儿听觉发育研究

发布时间：2018-04-29 13:56

  本文选题：miR-431 + 转基因小鼠　； 参考：《北京协和医学院》2014年博士论文

【摘要】：第一部分基础研究：基因表达谱分析miR-431导致小鼠耳聋的分子机制 目的：miR-431转基因小鼠ABR反应阈值升高,提示miR-431可能参与遗传性耳聋的调控。本研究通过基因表达谱分析,筛选鉴定miR-431转基因与野生型小鼠内耳组织中差异表达的基因,为探讨miR-431导致小鼠耳聋的分子机制奠定基础。 方法：提取ABR反应阈值升高的miR-431转基因小鼠和ABR反应阈值正常的野生型小鼠耳蜗总RNA,进行RNA测序。通过对测序结果进行生物信息学分析及GO注释,得到差异表达基因。然后,通过miR-431靶基因预测和遗传性耳聋基因信息库交叉筛选,得到miR-431介导的调控遗传性聋的候选基因。最后,通过Real-time RT-PCR方法验证RNA-seq数据可靠性；通过基因克隆、双荧光素酶报告基因系统(Luciferase)验证miR-431靶基因。 结果： 1、miR-431转基因小鼠ABR反应阈较野生型小鼠升高。A系Tg组小鼠平均听阈为42.3±14.7dB SPL,Wt组小鼠平均听阈为27.3±6.9dB SPL; B系Tg小鼠平均听阈为34.8±6.9dB SPL, Wt小鼠平均听阈为27.5±4.5dB SPL。 2、通过分析得到miR-431转基因小鼠较野生型小鼠表达差异大于1.5倍的基因2344个,大于2倍的有921个。其中上调基因,大于100倍的7个,10-100倍的77个,2-10倍的627个；其中下调基因大于100倍的4个,10-100倍的12个,2-10倍的194个。 3、通过差异表达基因与遗传性耳聋基因突变数据库联合分析,得到16个表达变化的耳聋基因,其中14个基因在Tg小鼠中表达下调,它们是CLDN14.COL11A2、 COL2A1、COL4A4、COL9A2、ESRRB、GJB2.MITF、OTOF, POU4F3, SEMA3E、 SIX5、SOX10、USH1C。2个基因表达上调,它们是：GJB3、GRHL2。 4、通过差异表达基因与遗传性耳聋基因突变数据库和miR-431预测的靶基因数据集做联合分析,鉴定了8个基因可能是miR-431介导的调控遗传性聋的候选基因,COL4A4、ESRRB、GJB2、MITF、OTOF、USH1C、SEMA3E和GRHL2。 5、Real-time RT-PCR方法验证了8个基因与RNA-seq结果一致。 6、双荧光素酶报告基因系统验证COL4A4、SEMA3E是miR-431调控的靶基因。 结论：miR-431可能通过调控COL4A4、SEMA3E表达影响小鼠听力。 第二部分临床研究：小耳畸形患儿听觉发育研究 目的：比较双侧先天性耳道闭锁、小耳畸形儿童与听力正常儿童听力及早期听觉发育的差别,分析佩戴软带骨锚式助听器(Bone-anchored hearing aid, Baha)对患儿改善听力及听觉发育的影响。 方法：软带Baha组共16例双侧先天性耳道闭锁、小耳畸形儿童,4岁组6例,4-6岁组10例,29例正常听力儿童作为对照组。4岁组患儿分别在3个测试时间点(佩戴软带Baha前、佩戴6个月及12个月后)应用婴幼儿有意义听觉整合量表(Infant-Toddler Meaningful Auditory Integration Scale, IT-MAIS)评估听觉发育情况。4-6岁组患儿分别在3个测试时间点应用有意义听觉整合量表(Meaningful Auditory Integration Scale, MAIS)评估听觉发育情况,并在声场下行纯音测听(pure tone audiometry, PTA)及应用普通话词汇相邻性单音节及双音节词表(Chinese Mandarin lexical neighborhood test, MLNT)检测言语识别率。 结果：4岁组患儿在3个测试时间点的IT-MAIS平均得分分别为41±24%、60±22%和73±7%。4-6岁组患儿在3个测试时间点的MAIS平均得分分别为66±7%、90±5%和99±2%。4-6岁组患儿声场下裸耳平均听阈为63±6dB HL,佩戴软带Baha后听阈提高至31±4dB HL。应用双音节易词测得的平均言语识别率(speech discrimination score, SDS)为74±19%、86±16%和95±4%；双音节难词平均SDS为48±18%、73±15%和81±7%；单音节易词平均SDS为55±17%、74±22%和83±14%；单音节难词平均SDS为31±14%、61±15%和71±13%。 结论：双侧先天性耳道闭锁、小耳畸形儿童早期佩戴软带Baha能够有效提高听力,听觉发育水平可接近健听婴幼儿。
[Abstract]:Part one basic research: molecular mechanism of miR-431 induced deafness in mice by gene expression profiling
Objective: the threshold of ABR reaction in miR-431 transgenic mice increased, suggesting that miR-431 might be involved in the regulation of hereditary deafness. This study screened the differentially expressed genes in the inner ear tissues of miR-431 transgenic mice and wild type mice by gene expression spectrum analysis, which laid the foundation for the study of the molecular mechanism of miR-431 causing deafness in mice.
Methods: miR-431 transgenic mice with elevated ABR reaction threshold and wild mouse cochlear total RNA with normal ABR reaction threshold were sequenced. The differentially expressed genes were obtained by bioinformatics analysis and GO annotation of the sequencing results. Then, the cross screening of the miR-431 target gene pre test and genetic deafness gene information library was carried out. The candidate genes regulating genetic deafness mediated by miR-431 were obtained. Finally, the Real-time RT-PCR method was used to verify the reliability of the RNA-seq data, and the miR-431 target gene was verified by the gene cloning and the dual luciferase reporter gene system (Luciferase).
Result锛，

本文编号：1820219