共培养系统中巨噬细胞对大鼠视网膜神经节细胞存活和轴突再生的影响

发布时间：2018-05-21 03:39

  本文选题：视网膜神经节细胞 + 巨噬细胞　； 参考：《第四军医大学》2010年硕士论文

【摘要】： 研究背景: 哺乳动物的视神经和视网膜是脑的衍生物,属于中枢神经系统(central nervous system,CNS)。视神经纤维由视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的轴突构成。在视神经损伤后,RGCs发生不可逆行性退变与、凋亡,,是导致视功能不可逆性损害的主要原因,也是在临床中青光眼、视网膜缺血性疾病等眼科疾病的主要损伤细胞。由此常造成严重的视力损害,临床上的治疗十分棘手。近年来视神经的保护和再生成为困扰医学界的世界性难题,对视神经再生各方面的研究也是众说纷纭。周围神经系统(peripheral nerveous system,PNS)和CNS损伤后都将发生一系列形态学变化:损伤远端轴突发生溃变,近端轴突少量溃变后长出神经芽突,同时受损区域周围胶质细胞增生。但是CNS和PNS不同,轴突发芽后不继续生长并且很快夭折。发生这种变化的一个主要原因是CNS和PNS的微环境不同,它们的髓鞘细胞类型不同,PNS的髓鞘是雪旺细胞(Schwann cell),而CNS是少突胶质细胞(oligodendroglia)。雪旺细胞可产生多种神经营养因子,能促进PNS轴突再生,少突胶质细胞则产生神经生长抑制因子,不利于CNS轴突的再生。 近年来,有学者发现在晶状体损伤后,可以在视神经损伤后促进视网膜神经节细胞的轴突再生。而晶状体损伤后可以引起眼内巨噬细胞的浸润,这提示巨噬细胞可能在视神经损伤后RGC存活和轴突再生中扮演重要角色。 因此,本实验通过分别对新生大鼠视网膜神经节细胞及成年大鼠腹腔巨噬细胞进行原代培养,利用Transwell小室建立两种细胞的共培养模型;观察巨噬细胞对RGC存活时间及轴突再生的影响。 目的 分别对成年SD大鼠腹腔巨噬细胞和新生SD大鼠视网膜神经节细胞进行的原代培养、纯化及鉴定;建立巨噬细胞/RGC的共培养模型,观察巨噬细胞对RGC存活时间及轴突再生长度的影响。 方法 1.大鼠腹膜腔注射DMEM培养液约6 mL,按摩腹腔10分钟后,用生理盐水10 mL灌洗腹膜腔。抽取腹膜腔细胞悬液,离心2次(1000r·min-1,5 min)。加DMEM培养液混悬细胞,37℃培养2 h后,D-Hanks液洗除漂浮的淋巴细胞,加入培养液继续培养。兔抗大鼠CD68单克隆抗体免疫细胞化学进行鉴定。 2.取出生1d SD仔鼠,断头处死后,在无菌条件下取眼球,解剖显微镜下去除眼前段,钝性分离视网膜,加入0.125%胰蛋白酶消化,37℃条件下放置20 min后,500 r·min-1离心3分钟,漂洗2次,去除上清液。加入培养液(含2% B27,15μg/mL BRDU的DMEM),钝头吸管吹打成单细胞悬液,行细胞计数,接种于24孔板中,置于培养箱中培养。兔抗大鼠GAP-43单克隆抗体免疫细胞化学进行鉴定。 3.采用transwell小室建立大鼠腹膜腔巨噬细胞和RGCs的共培养模型,不用巨噬细胞共培养的RGCs作为对照组,用胎盘蓝染色计数及相差显微镜观察RGCs存活的时间,并测量培养1 d、3 d和5 d时RGCs突起的平均长度,进行组间比较。 结果 成功获取并培养了大鼠巨噬细胞和RGCs,建立了两种细胞的共培养系统。1 d、3 d、5 d和7 d,共培养组平均RGCs活细胞数分别为(35.50±2.92)、(28.20±3.36)、(18.70±3.95)和(8.80±1.55),与对照组(36.20±2.35)、(27.10±2.96)、(15.80±3.04)和(8.40±2.01)比较,两组之间均无统计学显著性差异(P0.01)。但是,培养1 d、3 d和5 d,共培养组RGCs突起的平均长度分别为(19.79±3.98)μm、(68.30±4.07)μm和(95.51±6.51)μm,明显较长于对照组[(15.28±1.28)μm、(58.18±4.22)μm和(82.61±3.75)μm] (P0.01)。 结论 巨噬细胞可明显促进共培养的RGCs轴突的生长,但对其存活时间没有显著影响。
[Abstract]:Background of Study :


The optic nerve and retina of a mammal is a derivative of the brain , and belongs to the central nervous system ( CNS ) . The optic nerve fibers are composed of axons of retinal ganglion cells ( RGCs ) . After optic nerve injury , RGCs are non - reversible and apoptosis .


In recent years , some scholars have found that after lens injury , the axonal regeneration of retinal ganglion cells can be promoted after optic nerve injury , and the infiltration of macrophages in the eyes can be caused after lens injury , which suggests that macrophages may play an important role in RGC survival and axonal regeneration after optic nerve injury .


Therefore , in this experiment , the rat retinal ganglion cells and adult rat peritoneal macrophages were cultured in primary culture , the co - culture model of two kinds of cells was established by Transwell chamber , and the effects of macrophages on RGC survival time and axonal regeneration were observed .


Purpose


The primary culture , purification and identification of mouse retinal ganglion cells in adult SD rats were studied . The coculture model of macrophages / RGC was established to observe the effect of macrophages on RGC survival time and axonal regeneration length .


method


1 . The peritoneal cavity of rats was injected with DMEM culture solution about 6 mL . After 10 minutes of massage , peritoneal cavity was irrigated with 10 mL normal saline . The peritoneal cavity cell suspension was extracted and centrifuged twice ( 1000 r 路 min - 1 , 5 min ) . Add DMEM culture medium suspension cells , culture at 37 鈩，

本文编号：1917602