肺炎嗜衣原体假定T3SS效应蛋白Cpn0423、0710在感染细胞中定位的初步研究

发布时间：2018-06-07 19:17

  本文选题：肺炎嗜衣原体 + Cpn0423　； 参考：《南华大学》2011年硕士论文

【摘要】：目的: 评价肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae, Cpn)假定III型分泌系统(Type III secretion system, T3SS )效应蛋白Cpn0423和Cpn0710的免疫活性;检测其在Cpn感染的人喉癌上皮细胞(Hep-2)中的定位情况;观察Cpn0423和Cpn0710蛋白的表达时相,为寻找新的Cpn和宿主细胞相互作用的关键效应蛋白奠定基础。 方法: 提取重组质粒pGEX6p-2/Cpn0423和pGEX6p-2/Cpn0710,并转化至表达菌E.coli BL21中,IPTG诱导表达重组蛋白Cpn0423和Cpn0710,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和蛋白免疫印迹法(Western-Blot)分析和鉴定表达产物;采用GST纯化树脂纯化重组蛋白,并浓缩纯化蛋白,BCA法测定蛋白浓度;重组蛋白皮下注射免疫BALB/c小鼠,制备Cpn0423、Cpn0710多克隆抗体,ELISA法检测免疫小鼠血清中多克隆抗体的效价,分析重组蛋白的免疫原性;间接免疫荧光法(Indirect Immunofluorescence Assay, IFA)检测Cpn0423和Cpn0710蛋白在Cpn感染Hep-2细胞72h后的定位情况。同时应用IFA观察Cpn0423和Cpn0710蛋白在Cpn感染细胞6h, 12h, 24h, 36h, 48h, 72h, 96h, 120h后不同时间点表达量的变化及Cpn包涵体形态学上的变化特征。 结果: Cpn0423和Cpn0710重组蛋白在E.coli BL21菌中获得高效表达,Mr分别约为41kDa和35kDa,对温度、IPTG和时间等诱导表达条件进行系列的摸索优化后,获得可溶性表达蛋白;采用GST纯化树脂纯化获得纯度在95%以上的重组蛋白;重组蛋白免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测免疫血清特异性抗体,效价分别为1:16000和1:12000。Cpn成功感染Hep-2细胞,应用IFA检测Cpn0423和Cpn0710蛋白定位在宿主细胞胞浆,观察了Cpn包涵体随时间在感染Cpn细胞中形态学上的变化。 结论: (1)成功制备并纯化Cpn0423和Cpn0710重组蛋白; (2) Cpn0423和Cpn0710能刺激BALB/c小鼠产生高滴度的特异性抗体,具有较好的免疫原性; (3) Cpn0423和Cpn0710蛋白定位在宿主细胞胞浆,可能为Cpn分泌性蛋白。
[Abstract]:Objective: to evaluate the immunological activity of type III secretion system (T3SS) effector proteins Cpn0423 and Cpn0710 of Chlamydophila pneumoniae (Cpnae), and to detect the localization of Cpn0423 and Cpn0710 protein in Hep-2 cells, and to observe the expression phase of Cpn0423 and Cpn0710 protein. Methods: Recombinant plasmids pGEX6p-2 / Cpn0423 and pGEX6p-2 / Cpn0710 were extracted and transformed into E. coli BL21 to induce the expression of recombinant proteins Cpn0423 and Cpn0710. the recombinant proteins Cpn0423 and Cpn0710were induced by IPTG. SDS-PAGE and Western blot were used to analyze and identify the expressed products. The recombinant protein was purified by GST purified resin, and the protein concentration was determined by BCA method. The recombinant protein was injected subcutaneously to immunize BALB / c mice, and Cpn0423 (Cpn0710) polyclonal antibody was prepared by Elisa to detect the titer of polyclonal antibody in the serum of immunized mice. The immunogenicity of recombinant protein was analyzed, and the localization of Cpn0423 and Cpn0710 protein in Hep-2 cells was detected by indirect immunofluorescence assay (IFA). The expression of Cpn0423 and Cpn0710 proteins at different time points after 6 h, 12 h, 24 h, 36 h, 48 h, 72 h, 96 h and 120 h were observed by IFA. Results: the recombinant proteins Cpn0423 and Cpn0710 were highly expressed in E. coli BL21. The expression parameters were 41kDa and 35kDa, respectively. The induced expression conditions such as temperature, IPTG and time were optimized. Soluble expression protein was obtained, recombinant protein with purity above 95% was purified by GST purified resin, recombinant protein was immunized with BALB / c mice, specific antibody of immune serum was detected by indirect Elisa, the titers were 1: 16000 and 1: 12000.Cpn successfully infected Hep-2 cells. Cpn0423 and Cpn0710 proteins were detected by IFA in the cytoplasm of host cells. The morphological changes of CPN inclusion bodies over time in infected CPN cells were observed. Conclusion: the recombinant proteins Cpn0423 and Cpn0710 were successfully prepared and purified, and Cpn0423 and Cpn0710 stimulated BALBr / c mice to produce high titer specific antibodies. Cpn0423 and Cpn0710 proteins were located in the cytoplasm of host cells, which might be CPN secreted proteins.
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R739.65

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本文编号：1992490