RNAi沉默CD147基因对人喉癌细胞增殖、侵袭、顺铂敏感性及体内致瘤性的影响

发布时间：2018-07-15 07:13

【摘要】：目的：CD147,又名基质金属蛋白酶诱导因子,属于免疫球蛋白超家族的细胞膜表面高糖基化蛋白,在许多恶性肿瘤中表达增高,能促进肿瘤的存活、生长、侵袭与转移。CD147高表达还能提高肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。相关研究报道,CD147在喉癌细胞株Hep2中高表达,因此利用本实验室前期构建的CD147ShRNA真核表达载体,利用RNAi技术高效特异地沉默喉癌细胞株Hep2中CD147的表达,以分析其在喉癌侵袭、转移及其对顺铂敏感性的作用机制。 研究方法： 1)将前期构建的重组质粒pSilencer/shRNA-control、pSilencer/shRNA1、pSilencer/shRNA2稳定转染至Hep2细胞中,采用RT-PCR法和Western法分别检测转染细胞中CD147mRNA和蛋白表达的变化； 2)采用MTT法检测转染pSilencer/shRNA-control、pSilencer/shRNA1、pSilencer/shRNA2后Hep2细胞增殖水平的变化及其对化疗药物顺铂的敏感性； 3)采用Transwell法检测CD147shRNA对Hep2细胞的体外侵袭能力的影响； 4)采用明胶酶谱法检测转染pSilencer/shRNA-control、pSilencer/shRNAl、pSilencer/shRNA2后Hep2细胞培养液中MMP-2和MMP-9的活力； 5)采用裸鼠皮下异种移植模型观察CD147shRNA对Hep2细胞在体内侵袭和转移能力的影响。 结果： 1)所构建载体经阳离子脂质体介导转染人喉癌细胞株Hep2,G418筛选后有限稀释法成功获得阳性克隆株,RT-PCR法和western法显示两组ShRNA均高效而特异地沉默了喉癌细胞Hep2中CD147的表达。 2)MTT结果显示,在转染72h、96h、120h后,Hep2/shRNA1和Hep2/shRNA2组细胞增殖能力分别下降到了77.34%(P0.01)和70.43%(P0.01),62.99%(P0.01)和73.76%(P0.01),67.49%(P0.01)和61.37%(P0.01)。Hep2/shRNA1和Hep2/shRNA2组细胞对顺铂敏感性也明显增高。 3)细胞体外侵袭力测定结果显示：Hep2/shRNA1和Hep2/shRNA2组细胞的穿膜细胞数低于Hep2和Hep2/shRNA-control组。 4)明胶酶谱结果显示：Hep2/shRNA1和Hep2/shRNA2组的MMP-2和MMP-9明胶酶活性显著降低。 5) Hep2/shRNAl和Hep2/shRNA2组细胞在裸鼠皮下的成瘤体积较Hep2组分别降低’至38.35%和36.08%。 结论： 1)RNAi技术特异性沉默Hep2细胞CD147表达后,细胞增殖能力受到明显抑制,说明CD147能促进喉癌细胞的生长。 2)RNAi技术特异性沉默Hep2细胞CD147表达后,细胞对化疗药物顺铂的敏感性也明显增强,说明CD147可以作为化疗药物的一个靶分子。 3)Hep2细胞的CD147基因经RNAi技术特异性沉默后,细胞体外侵袭能力和体内成瘤能力明显降低,说明CD147与喉癌的进展相关,可能为一种新的喉癌治疗靶分子。
[Abstract]:Objective: CD147, also known as matrix metalloproteinase-inducible factor, belongs to the immunoglobulin superfamily with high glycosylated protein on the surface of the cell membrane. It is highly expressed in many malignant tumors and can promote the survival and growth of the tumor. High expression of invasion and metastasis. CD 147 also increased the resistance of tumor cells to chemotherapeutic drugs. The high expression of CD147 in laryngeal carcinoma cell line Hep2 was reported. Therefore, using the eukaryotic expression vector of CD147 ShRNA constructed in our laboratory, the expression of CD147 in laryngeal carcinoma cell line Hep2 was effectively and specifically silenced by RNAi technique to analyze the invasion of CD147 in laryngeal carcinoma cell line Hep2. The mechanism of metastasis and its sensitivity to cisplatin. Methods: 1) Recombinant plasmid pSilencer / shRNA-control pSilencer-1 pSilencer / shRNA2 was stably transfected into Hep2 cells. The expression of CD147 mRNA and protein in transfected cells was detected by RT-PCR and Western methods. 2) MTT assay was used to detect the proliferation level of Hep2 cells and its sensitivity to cisplatin after transfection of pSilencer- control pSilencer- / shRNA1pSilencer- pSilencer- rshRNA2.3The effect of CD147 shRNA on the invasiveness of Hep2 cells in vitro was detected by Transwell assay. 4) the activity of MMP-2 and MMP-9 in Hep2 cell culture medium after pSilencer- rshRNA-control-pSilencer- control pSilencer- psilencerrshRNA2 transfection was detected by gelatin zymogram. 5) the effect of CD147 shRNA on invasion and metastasis of Hep2 cells in vivo was observed by subcutaneous xenotransplantation in nude mice. Results: 1) the constructed vector was transfected by cationic liposome into human laryngeal carcinoma cell line Hep2G418. After screening with limited dilution method, positive clones were successfully obtained. RT-PCR and western showed that both groups were highly efficient and specific in silencing the larynx. Expression of CD147 in Hep2 cells. 2) MTT assay showed that, The proliferative ability of Hep2 / rshRNA1 and Hep2 / rshRNA2 groups decreased to 77.34% (P0.01) and 70.43% (P0.01), respectively, 62.99% (P0.01) and 73.76% (P0.01) 67.49% (P0.01) and 61.37% (P0.01). Hep2rshRNA1 and Hep2rshRNA2 cells were significantly more sensitive to cisplatin in vitro. The results of gelatinase analysis showed that the MMP-2 and MMP-9 gelatinase activities of the two groups were significantly lower than those of the Hep2 / rshRNA1 and Hep2 / shRNA2 groups. 5) the subcutaneous tumorigenic volume of Hep2p-shRNAl and Hep2p-shRNA2 cells in nude mice was higher than that of Hep2 fractions. Don't lower'to 38.35% and 36.08%. Conclusion: 1) after silencing the expression of CD147 in Hep2 cells by RNAi, the proliferation of Hep2 cells was significantly inhibited, indicating that CD147 could promote the growth of laryngeal cancer cells. 2) the expression of CD147 in Hep2 cells was specifically silenced by RNAi. The sensitivity of CD147 cells to cisplatin was also significantly increased, indicating that CD147 could be used as a target molecule of chemotherapeutic drugs. 3) the CD147 gene of Hep2 cells was silenced by RNAi technique. The ability of invasiveness in vitro and tumorigenesis in vivo were significantly decreased, which indicated that CD147 might be a new target molecule for laryngeal cancer treatment, which was related to the progression of laryngeal carcinoma.
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R739.65

【共引文献】

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本文编号：2123247