婴儿双歧杆菌对鼻咽癌组织乏氧区的靶向性研究

发布时间：2018-07-20 15:35

【摘要】：目的：研究婴儿双歧杆菌存在于鼻咽癌裸鼠模型的肿瘤组织靶向性。在此基础上,进一步研究婴儿双歧杆菌在肿瘤组织乏氧区的靶向性分布。方法：插块法建立鼻咽癌裸鼠模型,继续喂养1-2周,选取瘤块体积达到100mm3的荷瘤鼠随机分成实验组和对照组,每组各8只。实验组荷瘤鼠尾静脉注射婴儿双歧杆菌悬液(每只总菌量约为3×106-6×106cfu)0.2ml,对照组荷瘤鼠每只注射无菌PBS 0.2ml。第7天处死动物,并于处死前40min给予腹腔注射氢氧化哌莫硝唑(pimonidazole hydrochloride, HP-1)60mg/kg；颈椎脱臼法处死动物后,按无菌操作原则分别取肝、肺、肾、脾、心和肿瘤组织,并将肿瘤和脾脏各自均剖为两半,分别放置于福尔马林液固定和研磨缸中匀浆混合平板培养,其余器官组织直接在研磨缸中匀浆后混合平板培养。厌氧培养72h后可见部分平板上有乳白色、呈水样半透明、直径大小不等一般为1-2mm、边缘整齐的菌落生长,对混合平板培养的菌落计数,并根据公式：细菌总数(cfu/g)=同一稀释度平均菌落数(cfu)/涂布平板所用的稀释液体积(ml)×稀释倍数计算出各样本的细菌总数(cfu/g),以了解厌氧菌在实验组和对照组的定植生长情况,以及实验组厌氧菌在肿瘤及其他正常组织器官的蓄积生长情况。此外,对福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤和脾脏组织,切片经免疫荧光染色后置于荧光显微镜下观察、照相,在同一视野下对三种荧光燃料(FITC、Cy3、DAPI)特异性染色的切片分别用不同的激发光(红光、蓝光、紫外光)激发得到相应的图像。使用羊抗兔Cy3荧光二抗(红色)共轭兔抗婴儿双岐杆菌抗体显示组织内婴儿双岐杆菌,用羊抗鼠IgG FITC荧光二抗(绿色)共轭小鼠IgG抗乏氧探针抗体显示组织内乏氧细胞区域,用DAPI荧光染料(蓝色)显示组织内所有细胞胞核。由此,乏氧探针染色区域(绿色)指示肿瘤乏氧区；DAPI染色区域(蓝色)为肿瘤内所有细胞结构完整区胞核所在,肿瘤切片上DAPI染色缺失区域(无色)即为坏死区(细胞结构已破坏,核不着色)；而不在上述缺氧区、坏死区且DAPI胞核染色正常(蓝色)的区域即为富氧区。在我们的重合图中,婴儿双歧杆菌在乏氧区的分布为二者染色的重合(红色+绿色=黄色),在坏死区的分布为红色(红色+DAPI染色缺失=红色),在富氧区的分布为品红色(红色+蓝色=品红色)；采用IPP图像分析软件分析图像,分别计算出婴儿双歧杆菌在肿瘤组织乏氧区、坏死区和足氧区的分布比例,并用SPSS13.0统计软件对数据进行统计分析,以了解婴儿双歧杆菌瘤内分布的特点。结果：(1)组织匀浆厌氧培养后行菌落计数,发现未注射婴儿双歧杆菌的荷瘤鼠(对照组),无论是肿瘤组织还是肝、心、肺、脾、肾等正常组织的匀浆培养均未见厌氧菌生长；而注射了婴儿双歧杆菌的荷瘤鼠(实验组),分别对其肿瘤组织和肝、心、肺、脾、肾等正常组织的匀浆厌氧培养发现：婴儿双歧杆菌主要聚集生长于肿瘤组织,而在肝、心、肺、脾、肾等正常组织器官几乎未见蓄积,肿瘤组织中婴儿双歧杆菌的分布数值均数±标准差(x±s)为5086.25±2238.46 cfu/g(2.07×103-9.47×103cfu/g),正常组织器官中婴儿双歧杆菌的分布数值(x±s)为16.75±47.38 cfu/g (0-0.134×103cfu/g)。肿瘤与正常组织菌量之比超过300-500：1,差异有统计学意义(Z=-3.508,P0.05)；实验全程未发现受试裸鼠不适体征及安全事件。(2)组织切片的免疫荧光染色后,通过定量分析婴儿双歧杆菌在瘤内各区域的分布面积比例显示：婴儿双歧杆菌在肿瘤乏氧区的分布比例(0.6901±0.2137)明显高于其在坏死区(0.2994±0.2112)或富氧区(0.0105±0.0136)的分布比例(两两比较q检验分别q=9.1315,q=5.2557,均为P0.01),差异有统计学意义；婴儿双歧杆菌在坏死区的分布比例(0.2994±0.2112)明显高于其在富氧区的分布比例(0.0105±0.0136)(两两比较q检验q=3.8758,P0.05),差异有统计学意义。结论：在鼻咽癌裸鼠模型中,正常组织器官几乎未见婴儿双歧杆菌蓄积,该菌主要聚集生长于肿瘤组织,婴儿双歧杆菌对肿瘤组织具有良好的靶向分布能力,在肿瘤组织中其主要分布于肿瘤乏氧区。双岐杆菌没有致病性又能在肿瘤乏氧区中选择性定植的特点,使其具有基因治疗的载体系统的天然优势,具有良好的作为肿瘤基因治疗的载体的前景。
[Abstract]:Objective : To study the targeting of Bifidobacterium in nude mice model of nasopharyngeal carcinoma .
The total number of bacteria ( cfu / g ) of each sample was determined by immunofluorescence staining , and the total bacterial count ( cfu / g ) was observed under the same field of view .
The DAPI staining area ( blue ) is the nucleus of all cell structures in the tumor , and the DAPI staining loss area ( colorless ) on the tumor section is the necrotic area ( the cell structure has been damaged and the nucleus is not colored ) ;
The distribution of Bifidobacterium in the oxygen - rich region is red ( red + DAPI staining is missing = red ) , and the distribution in the oxygen - rich region is magenta ( red + blue = magenta ) .
The distribution ratio of Bifidobacterium in tumor tissue , necrotic area and foot oxygen area was calculated by using the IPP image analysis software . The data were analyzed by SPSS 13.0 software to understand the characteristics of the distribution of Bifidobacterium . Results : ( 1 ) No growth of anaerobe was found in the homogenate culture of normal tissues such as tumor tissue or liver , heart , lung , spleen and kidney .
The distribution values ( x 卤 s ) were 16.75 卤 47.38 cfu / g ( 2.07 脳 103 - 9.47 脳 103 cfu / g ) and 16.75 卤 47.38 cfu / g ( 0 - 0.134 脳 103 cfu / g ) respectively .
( 2 ) The distribution ratio of Bifidobacterium in tumor - free zone ( 0.6901 卤 0.2137 ) was significantly higher than that in the necrotic area ( 0.2994 卤 0.2137 ) or oxygen - enriched area ( 0.0105 卤 0.0136 ) .
Conclusion : In the nude mice model of nasopharyngeal carcinoma , there is little accumulation of Bifidobacterium in normal tissues , which mainly focuses on tumor tissues .
【学位授予单位】：泸州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R739.63

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