纤溶酶原激活剂及其相关分子在小鼠视神经损伤与再生中的变化

发布时间：2018-09-05 11:58

【摘要】： 众所周知,在成年哺乳动物,与周围神经系统相比,中枢神经系统受损后再生和功能恢复比较困难。已有研究发现,虽然中枢神经元轴突本身具有类似的再生潜能,但受损神经元所处的微环境可能是决定其再生失败的重要原因。中枢神经损伤后,在损伤区形成由变性髓鞘碎片、坏死细胞、沉积纤维蛋白和胶原纤维等成份组成的致密的胶质瘢痕,使大多数发芽的轴突不能越过此胶质瘢痕而停止生长。为了促进新生轴突能够穿越这些胶质瘢痕到达失神经支配的靶器官,大量的蛋白酶参与了此过程。纤溶酶原激活剂(Plasminogen activators,PAs)是一种丝氨酸蛋白酶,在体内主要是通过激活纤溶酶原(Plasminogen,Plg)转变为纤溶酶(plasmin,Pln),后者是一种广谱的蛋白水解酶,能够降解细胞外的细胞受体、生长因子及细胞外基质组分。金属基质蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是一组锌依赖的蛋白水解酶,由正常组织细胞和炎症及肿瘤细胞产生,以无活性的酶原形式分泌,参与细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的降解及ECM不同组成成分的重塑,参与神经系统的病变调控和组织修复过程。本课题以属于中枢神经的小鼠视神经为研究对象,通过建立成年小鼠视神经夹伤模型,用形态学和生物学方法研究小鼠视神经损伤后及其再生过程中,神经夹伤部位破损血管中溢出的血源性因子,主要包括：免疫球蛋白(immunoglobulinG,Ig G)、纤维蛋白(原)(fibrin(ogen))、纤溶酶原激活物(plasminogen activators,PAs)及金属基质蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表达变化情况,以了解ECM各蛋白酶在视神经损伤后的变化,分析ECM蛋白酶活性的变化与小鼠视神经损伤及再生之间的关系,为更深一步揭示炎症性损伤的中枢神经的再生修复微环境所起作用奠定基础。材料与方法健康成年雄性C57 BL／6J小鼠,腹腔注射麻醉后,行外眦切开术,暴露视神经,在距视神经球后起始部约2mm处,用显微钳钳夹视神经45s；缝合皮肤切口。左眼作为自身对照,仅暴露视神经,不作钳夹处理。模型鼠构建完成后,于术后1h、2h、4h、8h、16h、1d、2d、7d和28d分别进行心脏灌注冲洗血液,取材做组织切片及提取视神经蛋白,采取HE染色测定在小鼠视神经夹伤后视神经的变性,用Western blot方法检测损伤后不同时间点视神经组织内神经丝(Neurofilament,NF)、MMP-9、fibrin(ogen)、IgG的表达量变化情况,同时采用原位酶谱分析法检测plasminogen activators(PAs)活性在视神经损伤后各阶段的变化。结果 HE染色结果显示,随着小鼠视神经夹伤后的时间延长,视神经溃变逐渐加重,视神经纤维走行迂曲、排列不规则,胶质细胞核增多、排列紊乱,可见细胞呈空泡样变性。 Western blot方法结果显示,正常视神经组织内NF蛋白表达水平较高,在损伤早期,视神经组织中NF维持较高的水平(接近于对照),直至损伤后第7d,NF的表达呈现出明显的下降,至损伤后28天视神经组织内仅能检测到少量NF。在正常视神经组织内,只有微量的IgG表达,而损伤侧的视神经组织内IgG表达水平明显增加,损伤后28d仍能检测出大量的表达；只有微量的纤维蛋白沉积在对照侧正常神经组织内,而损伤侧神经组织在损伤后l小时就能检测出纤维蛋白的溢出,至损伤后第7d纤维蛋白沉积基本被清除。在对照侧神经组织内,只有微量的MMP9表达,损伤后的视神经MMP-9的蛋白水平有少许增加,在损伤后2d达到高峰,以后仍有高水平的表达,但MMP-9是以活性较低的前体形式存在的,分子量92 KDa。原位酶谱法结果显示,视神经损伤后1d视神经周围即可见边界清晰的黑色溶解带,至损伤后第7d溶解带范围最大,而反应体系中给予特异性的尿激酶型纤溶酶原激活剂(Urokinase Plasminogen Activator,uPA)酶活性抑制剂阿米洛利将uPA酶活性抑制后,发现黑色溶解带几乎消失。表明PA活性在视神经损伤后即出现增高,在损伤后第7天达到高峰,一直持续到第28天时仍有很高的活性,且起作用的PA主要是uPA。结论小鼠视神经夹伤动物模型的成功建立,为研究微环境在中枢神经损伤及再生中的作用提供了有用的工具。沉积于损伤部位的fibrin(ogen)清除情况与IgG不同,不依赖于BNB的彻底修复,表明CNS的损伤,能够引发较为迅速强烈的PA／P1g／Pln级联的快速激活。MMP-9以无活性的前体形式蓄积,一旦被激活,受损的神经极有可能面临更加严峻的微环境。uPA可以清除视神经损伤部位沉积的fibrin(ogen),修复该异常蓄积引发的不利于神经再生的蛋白水解微环境,还能通过Plg／Pln级联改变损伤部位的细胞外基质。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R774.6

【参考文献】