小鼠眼部碱烧伤后骨髓间充质干细胞归巢到角膜组织的检测及影响因素分析

发布时间：2018-10-04 22:05

【摘要】：第一章小鼠碱烧伤完全性角膜缘干细胞功能失代偿模型的建立及评价目的建立模拟临床的小鼠碱烧伤完全性角膜缘干细胞功能失代偿模型,为研究碱烧伤引发的完全性角膜缘干细胞功能失代偿提供简单、稳定的动物模型。方法选取6-8周龄C57小鼠30只,全身麻醉后将浸有0.5mol/L氢氧化钠溶液的环形滤纸片(内径3mm,外径5mm)置于角膜缘30秒后取下,然后应用生理盐水冲洗结膜囊30秒；术后1天、3天、5天、7天、10天、14天、21天及30天,应用裂隙灯显微镜观察角膜上皮完整性、基质透明性及新生血管化情况；每个时间点随机抽取3只小鼠取材,进行组织病理学检查；术后21天进行角膜免疫印迹细胞学检查。结果 ①裂隙灯检查：术后1天：角膜缘缺血,可见边界清楚的灰白色环状混浊区,大小与滤纸片直径一致,全角膜水肿、上皮缺损；术后3-5天：角膜灰白色混浊,水肿加重；术后7-10天：角膜水肿逐渐减轻,上皮恢复完整；术后14天：角膜缘可见毛刷状新生血管生长；术后21天：角膜缘较多新生血管长入角膜基质；术后30天：角膜混浊、新生血管化,部分模型发生睑球粘连； ②HE染色：术后1-5天：角膜上皮层、基质层内可见大量炎症细胞浸润,角膜基质水肿、明显增厚、胶原纤维排列不规则、较疏松；术后7-10天：角膜表面单层上皮覆盖,基质水肿逐渐减轻,炎症细胞浸润减少；术后14天：角膜表面覆盖2-3层上皮细胞,基质无明显水肿,胶原纤维排列相对整齐；术后21天：角膜基质内较多新生血管增生,管腔内有成熟红细胞；术后30天：角膜上皮层内可见较多杯状细胞； ③免疫印迹细胞学检查：角膜表面可见较多核大、核质比例约1/2、嗜伊红染色的杯状细胞,PAS染色阳性,为结膜细胞表型。结论 ①应用环形滤纸片碱烧伤的方法制作小鼠完全性角膜缘干细胞功能失代偿模型,角膜表面可见较多杯状细胞,裂隙灯检查见小鼠角膜的体征符合临床上“完全性角膜缘干细胞功能失代偿”的诊断标准。 ②此方法操作简单,易于重复,为下一步的在体研究提供了良好的动物模型。第二章小鼠眼部碱烧伤急性期骨髓间充质干细胞归巢到角膜组织的检测目的观察小鼠眼部碱烧伤急性期骨髓间充质干细胞归巢到角膜组织的时间窗、定植位置、以及影响因素。方法选取6-8周龄C57小鼠80只,随机分为骨髓功能正常组、骨髓功能动员组(皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子)及球结膜下注射组(球结膜下注射GFP转染的小鼠骨髓间充质干细胞),建立完全性角膜缘干细胞功能失代偿模型,分别于碱烧伤后1天、3天、5天、7天、10天、14d天、21天及30天取材： ①冰冻切片行CD29、CD44及CD45免疫荧光染色；球结膜下注射组应用荧光显微镜观察GFP阳性细胞在眼表的位置； ②实时定量PCR检测CD29、CD44、CD45、CD90、CD105及基质衍生因子1(SDF-1)的表达； ③包埋切片行SDF-1免疫组织化学检测。结果 ①免疫荧光染色：两组呈现类似的表达规律：碱烧伤术后1-10天,角膜中央、周边及角膜缘均未见CD29、CD44及CD45表达；术后14d、21d、30d,角膜缘可见少量CD29、CD44阳性表达,阳性反应物主要位于胞膜,但CD45均为阴性。 ②荧光显微镜：术后1天、3天、5天及7天,球结膜下、角膜缘及角膜中央均未见GFP阳性细胞； ③实时定量PCR：两组呈现类似的表达规律：CD29、CD44、CD90及CD105：碱烧伤术后1-7天均未见表达,术后10天、14天、21天、30天呈现低水平表达；CD45：各个时间点均为阴性。 ④免疫组织化学检测：两组呈现类似的表达规律：术后7天：SDF-1呈现强阳性表达,阳性反应物主要位于角膜上皮细胞胞浆内；术后10-14天：阳性反应物逐渐减少；术后21天：SDF-1表达呈现阴性。结论 ①小鼠眼部碱烧伤后14-30天,仅有少量骨髓间充质干细胞归巢到角膜组织并聚集在角膜缘部位。 ②小鼠眼部碱烧伤后SDF-1表达增加,时间-剂量关系与心肌等组织相似,不是抑制骨髓间充质干细胞归巢的关键因素。第三章眼表炎症因子及高渗透压环境对小鼠骨髓间充质干细胞生物学性状的影响目的检测眼表主要炎症因子(白介素-lβ)及高渗透压环境(406Osm)对小鼠骨髓间充质干细胞形态、活细胞率、增殖及迁移能力等生物学性状的影响。方法体外分离小鼠骨髓间充质干细胞进行培养,设置正常对照组、5ng/ml IL-1β组、10ng/ml IL-1β组、20ng/ml IL-1β组及高渗组,分别应用MTT法、细胞克隆形成试验、划痕法进行检测。结果 ①细胞形态：原代培养的细胞呈梭形,排列具有方向性,胞浆丰富,细胞核较大,呈圆形,位于细胞中央；5ng/ml IL-1β组细胞形态无明显差异；随着培养基中IL-1β浓度升高,出现较多漂浮细胞,细胞变小,多呈圆形；高渗组培养基中出现大量漂浮细胞,贴壁细胞排列松散,形态不规则,失去梭形外观,细胞膜皱缩,反光增强。 ②MTT法：正常对照组吸光度(0D值)为0.498±0.043(n=5)；5ng/m1IL-1β组0D值为0.499±0.038(n=5),与正常对照组相比,t=-0.035,P=-0.974,差异无统计学意义；10ng/ml IL-1β组、20ng/ml IL-1β组及高渗组0D值明显减少,以高渗组为著,与正常对照组相比,tr,=6.209,Pt=0.003,t2=8.881,P2=0.001,tr=10.146,P.0.001,差异均具有统计学意义； ③细胞克隆形成试验：正常对照组细胞能形成较多克隆,克隆形成率为18.200±1.923％(n=3)；5ng/ml IL-1β组克隆形成率下降至17.400±2.074%(n=3),与正常对照组相比,t=0.667,P=0.541,差异无统计学意义；10ng/ml IL-1β组、20ng/m1IL-1β组及高渗组克隆形成率进一步减少,以高渗组为著,与正常对照组相比,t1,=12.348,P1=0.000,t2=17.250,P2=0.000,t3=11.943,P3=0.000,差异均具有统计学意义； ④划痕法：正常对照组细胞迁移能力旺盛,72小时全部越过划痕；5ng/ml IL-1β组细胞迁移能力未受明显影响,72小时全部越过划痕；10ng/ml IL-1β组、20nng/mlIL-1β组及高渗组24小时、48小时及72小时细胞迁移能力均明显下降,以高渗组为著,与正常对照组相比,差异均具有统计学意义。结论 ①眼表高渗透压环境能够显著地抑制骨髓间充质干细胞的迁移、增殖能力,较多细胞出现死亡现象。 ②低浓度IL-1β(5ng/ml)不具有细胞毒性,并且对骨髓间充质干细胞的迁移、增殖能力无明显影响。 ③随着培养基中IL-18浓度的升高(lOng/ml,20ng/ml),细胞毒性逐渐显现,不同程度地抑制了骨髓间充质干细胞的迁移、增殖能力。第四章小鼠眼部碱烧伤稳定期骨髓间充质干细胞归巢到角膜组织的检测目的观察小鼠眼部碱烧伤稳定期骨髓间充质干细胞归巢到角膜组织的时间窗及定植位置。方法选取6-8周龄C57小鼠80只,建立完全性角膜缘干细胞功能失代偿模型,眼局部应用抗炎药物一个月后进行后续实验。随机分为骨髓功能正常组(30只)、骨髓功能动员组(30只)及球结膜下注射组(20只)。分别于碱烧伤后1天、3天、5天、7天、10天、14天、21天及30天取材,进行裂隙灯照相、免疫荧光染色以及实时定量PCR检测。结果 ①裂隙灯照相：骨髓功能动员组及球结膜下注射组：小鼠角膜新生血管化程度降低,两组之间无明显差异。 ②免疫荧光染色：骨髓功能正常组：各个时间点,角膜缘可见极少量CD29、CD44表达,CD45均为阴性。骨髓功能动员组：术后1-3天,角膜缘可见少量CD29、CD44表达；术后5-10天,CD29、CD44阳性表达增加,CD45表达均为阴性；术后14天,CD29、CD44阳性表达开始减少；术后21天,CD29、CD44及CD45表达均为阴性； ③实时定量PCR： CD29、CD44、CD90及CD105的表达规律：骨髓功能正常组：各个时间点表达量较低；骨髓功能动员组：术后1-3天,表达量较低；5天开始升高,7-10天维持较高水平,14天时开始下降,21天少量表达,30天呈现阴性；球结膜下注射组：术后ld呈现高表达,以后逐渐降低,10d表达呈现阴性。骨髓功能动员组及球结膜下注射组角膜缘CD29、CD44、CD90及CD105的表达量明显高于中央角膜。 ABCG2、P63、CK3/12及CK19的表达规律：骨髓功能动员组：ABCG2、P63及CK3/12表达量较高,CK19表达量较低,与骨髓功能正常组相比,差异均具有统计学意义；球结膜下注射组：ABCG2、P63及CK3/12表达量低于骨髓功能动员组,CK19表达量高于骨髓功能动员组,但二者相比,差异均不具有统计学意义。结论 ①眼表微环境改善后,归巢到角膜组织的骨髓间充质干细胞明显增多,并有利于眼表向角膜上皮表型分化；应用粒细胞集落刺激因子进行骨髓动员可以提高归巢效率。 ②稳定期球结膜下注射骨髓间充质干细胞的眼表重建效果略优于骨髓动员,但持续时间较短。 ③经骨髓动员或结膜下注射归巢到角膜的骨髓间充质干细胞均聚集在角膜缘处,不向角膜中央发生移动。
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【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R772.2

【参考文献】