人高分化喉鳞状细胞癌细胞系FD-LSC-1的建立、鉴定及特征分析

发布时间：2018-10-12 20:57

【摘要】：第一部分：人高分化喉鳞状细胞癌细胞系FD-LSC-1的建立此部分研究旨在通过采集喉癌标本组织直接进行原代细胞培养来建立一株新的能够代表近年来中国喉癌喉人群部分发病机制及生物学特征的喉鳞状细胞癌细胞系。本研究中,我们尝试收集了2011年6月-2011年12月在我院确诊为喉鳞状细胞癌的40位患者的喉癌组织标本,其中会厌癌29例,声门癌8例,颈部转移淋巴结3例,均为男性患者,年龄46-68岁。将收集的标本组织在24小时之内进行洗涤、消毒、机械剪碎及胶原酶消化后直接进行原代细胞培养或组织块培养,对生长出的喉癌上皮细胞进行传代、纯化、流式细胞仪及免疫荧光纯度测定、定期冻存、支原体污染检测及复苏活性测定。同时采集癌旁正常上皮组织进行同法原代培养,作为肿瘤细胞的对照。结果发现：喉癌组织或细胞在体外直接进行原代培养比较困难,细菌及真菌污染和癌细胞不贴壁是培养过程中的主要问题,即使贴壁生长,绝大多数不超过3代。从40例喉癌标本中我们仅成功建立了一株新的喉鳞状细胞癌细胞系,命名为FD-LSC-1,来自于一位未经治疗的分化良好的会厌鳞癌伴双颈部淋巴结转移(IVa, T4aN2M0)的68岁男性患者的会厌病灶,该患者没有喉癌家族史,但有40余年的吸烟史及30余年的饮酒史。FD-LSC-1细胞在体外传代超过100代,癌细胞已纯化,没有支原体污染,冻存后复苏的FD-LSC-1细胞活性良好。癌旁正常上皮也成功培养传代到第8代。以上结果表明：人喉鳞癌FD-LSC-1细胞系已经初步建立达永生化；喉鳞癌原代细胞在体外较难成活和培养建系,可能与喉癌病灶大多原发于有菌腔道且与空气、消化液或痰液接触有关；成功建立能够在体外稳定生长和连续传代的喉鳞癌细胞系是一项艰苦的工作,需要经过多次尝试和多次失败才能偶获成功。第二部分：人高分化喉鳞状细胞癌细胞系FD-LSC-1的鉴定此部分研究旨在对新建立的喉鳞癌FD-LSC-1细胞系进行进一步鉴定,包括三部分内容：首先是种属鉴定,确认FD-LSC-1细胞系是人来源的；其次是细胞组织来源鉴定,确认FD-LSC-1细胞系是上皮组织细胞来源的；最后是恶性生物学特征的鉴定,确认FD-LSC-1细胞系是恶性肿瘤。本研究中,首先利用目前最权威的短串联重复序列(short tandem repeat,STR)图谱技术对FD-LSC-1细胞系的17个短串联重复序列基因座及一个性别决定基因座(Amelogenin)进行了检测分析,通过美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection, ATCC)对检测结果进行了种属鉴定,并与美国ATCC及欧洲微生物和细胞培养物收藏中心(DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)中的遗传信息进行比对,检测有无被现存的任何细胞系污染；其次,利用相差显微镜观察FD-LSC-1细胞的形态,利用免疫荧光法检测FD-LSC-1细胞广谱角蛋白及波形蛋白的表达情况,利用透射电镜技术检查上皮超微结构；最后,对FD-LSC-1细胞系进行了恶性生物学特征的鉴定,包括：吉姆萨(Giemsa)染色形态学观察、透射电镜癌细胞超微结构检查、染色体组核型分析、流式细胞仪DNA倍体分析、软琼脂集落形成能力检测及免疫缺陷小鼠致瘤能力的检测。结果发现：首先,美国ATCC的检测报告确认FD-LSC-1细胞系是人来源的细胞系,并且没有受到美国ATCC及欧洲DSMZ细胞库中任何细胞系的污染。其次,相差显微镜观察发现FD-LSC-1细胞呈鹅卵石样单层贴壁生长,胞浆内常可见空泡,与人喉表皮样癌HEp-2细胞系的多边形不同；细胞免疫荧光检测发现FD-LSC-1细胞为广谱角蛋白阳性而波形蛋白阴性；透射电镜检查发现FD-LSC-1细胞之间可见桥粒,胞浆内可见张力丝等上皮超微结构。最后,对FD-LSC-1细胞系进行的恶性生物学特征检测发现：Giemsa染色的FD-LSC-1细胞核分裂像明显活跃,胞核大,核浆比例增大,可见巨核细胞；透射电镜癌细胞超微结构检查发现FD-LSC-1细胞胞浆内线粒体、核糖体及粗面内质网丰富：染色体组核型分析提示FD-LSC-1细胞系存在明显的数量异常和复杂的结构异常,染色体众数为68,为近3倍体,结构异常包括染色体增加、缺失及易位等；流式细胞仪DNA倍体及细胞周期分析发现,与宫颈癌Hela细胞系相比,FD-LSC-1细胞系G0/G1期比例下降,S期比例增高,而G2/M期比例类似；FD-LSC-1细胞系未能够在半固体软琼脂培养基中形成集落；FD-LSC-1细胞能够顺利在免疫缺陷小鼠皮下形成移植瘤,移植瘤HE(hematoxylin eosin)染色病理提示为高分化鳞癌。以上结果表明：经过种属、组织来源及恶性生物学特征的鉴定,新建立的FD-LSC-1细胞系符合癌细胞系所必需的各项生物学特征,可以确认是人喉上皮组织来源的高分化鳞癌细胞系,且没有被目前存在的任何细胞系污染。第三部分：人高分化喉鳞状细胞癌细胞系FD-LSC-1的特征分析此部分研究旨在对已经过鉴定的人高分化喉鳞癌FD-LSC-1细胞系进行个性化的特征分析,包括：体外培养群体倍增时间、迁移侵袭潜能、放化疗敏感性、Notchl及EGFR (epidermal growth factor receptor)通路、CK(cytokeratin) 5及Ki67的蛋白水平、TP53基因突变、人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染、头颈鳞癌相关分子标记物检测、头颈鳞癌相关失调基因检测及头颈鳞癌相关失调microRAN检测,为FD-LSC-1细胞系贴上个性化的特征标签。本研究中,利用CCK-8(cell counting kit-8)试剂盒对FD-LSC-1细胞系进行了体外培养的群体倍增时间测定,以Hela细胞系为对照利用包被基质胶的Transwell小室对FD-LSC-1细胞系进行了迁移及侵袭能力的检测,再以Hela细胞系为对照利用X射线及顺铂对FD-LSC-1细胞系进行了放化疗敏感性的检测,利用Western Blot技术对FD-LSC-1细胞系的Notch、EGFR、CK5及Ki67的蛋白水平进行了检测,利用基因测序技术对FD-LSC-1细胞系TP53抑癌基因的全部外显子进行了突变检测,利用两对通用引物结合PCR (polymerase chain reaction)技术对FD-LSC-1细胞系的HPV感染情况进行了检测,利用免疫组化和免疫荧光技术对FD-LSC-1细胞系的头颈鳞癌相关重要分子标记进行了检测,利用SYBR Green实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR,quantitative rael-time polymerase chain reaction)对FD-LSC-1细胞系的头颈鳞癌相关失调基因进行了检测以及利用TaqMan探针qRT-PCR技术对FD-LSC-1细胞系头颈鳞癌相关失调miRNA进行了检测。结果发现：FD-LSC-1细胞系在体外培养的群体倍增时间约为24小时,FD-LSC-1细胞系比Hela细胞具有更强的迁移及侵袭潜能但对放化疗相对更敏感,FD-LSC-1细胞系具有激活的Notchl和EGFR信号通路以及上调的CK5和Ki67蛋白水平, FD-LSC-1细胞系TP53基因第5和8外显子分别发生了错义突变和无义突变,FD-LSC-1细胞系没有被HPV感染,FD-LSC-1细胞系表达ADAM10及MLH1等重要的头颈鳞癌相关分子标记物,SYBR Green qRT-PCR技术发现了FD-LSC-1细胞系有TERT等14个头颈鳞癌相关上调基因及KRT4等14个下调基因,TaqMan探针qRT-PCR技术发现了FD-LSC-1细胞系有miRNA-21等9个头颈鳞癌相关上调miRNA及miRNA-138等10个下调miRNA。以上结果表明：经过对已鉴定的人高分化喉鳞癌FD-LSC-1细胞系进行倍增时间等9项个性化的生物学特征分析之后,FD-LSC-1细胞系已经被建立、鉴定及较好地特征化,为进一步有针对性地利用FD-LSC-1细胞系对我国喉鳞癌人群的发病机制及肿瘤生物学特性进行研究奠定了基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.65

【参考文献】