microRNA在耳蜗前体细胞增殖和分化中的作用探讨

发布时间：2018-10-17 13:27

【摘要】：在耳科学领域,探索耳蜗的发育机制和毛细胞的再生机制是两个具有挑战性的难题。在新生的鼠类耳蜗内,仍然能够分离和培养出具有增殖能力的前体细胞,这些耳蜗前体细胞(CPCs)在体外能够分化出耳蜗毛细胞以及其他种类的耳蜗细胞。这些前体细胞被认为可能应用于毛细胞损伤缺失后的替代治疗,更重要的是,在体外诱导分化这些前体细胞可以为我们提供一个研究耳蜗发育和毛细胞再生的体外模型。 microRNA(miRNA)是一类能够调节细胞增殖、分化以及干细胞命运的内源性非编码小RNA。目前尚无关于miRNA在耳蜗前体细胞增殖和分化中表达和功能的研究。在本研究中,我们首次利用微芯片及实时定量PCR等技术发现了在CPCs分化过程中表达的全部miRNA及其表达模式,与神经干细胞(NSCs)比较后,发现miR-183家族具有CPC细胞表达特异性。这些结果表明miRNA可能在CPC的增殖和分化中发挥了不同的作用,还可能决定了CPC向毛细胞的定向分化。 使CPCs过表达目的miRNA或目的miRNA的互补反义链可以分别通过“gain-of-function”和“loss-of-function”实现对miRNA功能的验证。但目前尚无成功转染CPCs的相关报道。我们首次观察和比较了三种不同的转染方法对CPCs的转染率和对细胞存活率的影响。初步证明了腺病毒介导的基因转导是使耳蜗前体细胞过表达目的基因的最佳途径与方法。 实验一耳蜗前体细胞和神经干细胞的分离培养和分化 目的分离、培养新生大鼠仔鼠耳蜗中的前体细胞(cochlear progenitor cells,CPCs)和胚胎鼠中来源于嗅球部位的神经干细胞(neural stem cells, NSCs),并对两种细胞进行体外诱导分化。 方法从新生0至3天的大鼠耳蜗基底膜中分离出CPCs,进行原代培养,分别用免疫细胞荧光和免疫细胞化学方法检测BrdU和nestin在CPCs中的表达情况,鉴定前体细胞的增殖能力和细胞特性。用血清诱导前体细胞分化,用免疫细胞荧光的方法检测CPCs是否具有分化成毛细胞的能力。从发育15天的SD大鼠胚胎鼠的嗅球中分离出NSCs,并进行传代培养。用血清诱导传代第4代的NSCs进行分化。 结果原代培养的CPCs第18小时后可见少量细胞球形成,随着培养时间的延长,可见细胞球数量逐渐增多,组成细胞球的细胞数目也增多。细胞球内绝大部分细胞BrdU和nestin阳性。随着培养时间的延长,细胞球的形态发生改变,增殖能力明显下降,而且部分细胞球自行贴壁,无法进行严格意义上的传代。经分化诱导后,细胞球贴壁生长,14天后,对分化细胞行免疫荧光化学染色,发现部分细胞表达毛细胞标志物myosin VIIA。NSCs增殖能力非常强,可传至少40代,持续6个月,分化后的细胞形态与CPCs来源的分化细胞显著不同。 结论本部分实验表明CPCs具有一定的增殖能力,也可以分化出毛细胞样细胞,但并非严格意义上的干细胞,只能称其为耳蜗来源的前体细胞,它可作为耳蜗发育和毛细胞再生的体外研究模型。本部分实验为研究和比较miRNA在CPCs和NSCs分化过程中的表达变化奠定基础。 实验二耳蜗前体细胞分化过程中miRNA的表达变化 目的miRNA具有调节细胞增殖、分化、凋亡和影响细胞命运的重要作用。目前关于miRNA在CPCs中的表达和功能研究尚未见任何报道。我们拟用高通量的miRNA芯片检测目前已知所有的miRNA在CPCs增殖和分化过程中的表达模式。 方法收集CPCs细胞球和CPCs来源的分化6天和14天的细胞,提取总RNA,通过质量检测后用Hy3标记探针,用LNA miRNA芯片进行杂交,然后扫描芯片并分析所有目前已知的miRNA的表达荧光信号强度,经过信号标准化和数据处理后绘制miRNA的表达模式图。分析并比较每个miRNA在三个时间点的表达变化。 结果近有100个miRNA在CPCs的分化过程中可以检测到。随着分化的进行,大部分的miRNA都出现明显的表达变化。这些miRNA之间的表达丰度跨度巨大,而且具有不同的表达模式,miR-125b-5p, miR-494和miR-22是表达量最高的三个miRNA。在检测到的miRNA中,最为常见的三种表达模式是:1.在未分化状态下表达水平达到峰值; 2.在分化第6天的时候表达水平达到峰值; 3.在分化第14天的时候表达水平达到峰值。 结论本部分实验表明在CPCs不同分化阶段,具有不同的miRNA表达谱系。miRNA表达水平的时序性调节变化暗示着这些miRNA在不同的分化阶段发挥不同的作用。 实验三实时定量PCR技术比较miRNA在不同种类细胞中的表达模式 目的用miRNA时实定量RT-PCR技术验证芯片结果,检测miR-21、miR-503、let-7a和let-7f及miR-183家族在CPCs分化过程中的表达变化,检测miR-183家族在NSCs分化过程中的表达变化。对比miR-183家族在两种细胞中的表达情况。 方法收集CPCs细胞球和CPCs来源的分化6天和14天的细胞,提取总RNA,用miRNA qRT-PCR技术检测miR-21、miR-503、let-7a、let-7f、miR-96、miR-182和miR-183在三个分化时间点的表达变化。收集NSCs细胞球和NSCs来源的分化6天和14天的细胞,提取总RNA,用miRNA qRT-PCR技术检测miR-183家庭在三个分化时间点的表达变化。 结果miR-21、miR-503、let-7a和let-7f的表达趋势与其在miRNA芯片中的结果基本一致。miR-21、let-7a和let-7f具有相似的表达模式,均在分化6天的时候达到峰值。而miR-503具有不同的表达模式,随着分化的进行,miR-503的表达水平逐渐升高,在分化第14天阶段表达水平达到高峰,此变化亦具有统计学意义。miR-183家族的三个成员表达模式不同,miR-96和miR-182的表达量均随着分化的进行不断下降,而miR-183的表达与miR-21相似在分化6天时达到高峰。miR-96和miR-183均无法在NSCs分化过程中检测到,miR-182仅能在未分化的NSCs中检测到,但表达量极低。经统计学检测,以上变化均具有统计学意义。 结论本部分实验结果表明了LNA芯片结果的可靠性。在CPCs分化中不同的miRNA可能有类似的功能。miR-183家族具有CPC的细胞表达特异性,这种特导性可能影响了干细胞向CPCs的分化,也可能决定了CPCs向多种耳蜗细胞的特异性分化。 实验四耳蜗前体细胞过表达目的基因方法的建立 目的能够使CPCs过表达或低表达miRNA是验证miRNA功能的首要条件。但目前尚无成功转染CPCs的相关报道。我们分别观察脂质体转染、电穿孔转染和腺病毒感染三种方法对原代培养的CPCs的转染率。为日后研究miRNA在CPCs中发挥的作用奠定实验技术基础。 方法用不同比例的EGFP质粒/脂质体复合物和不同的孵育时间转染CPCs;设置不同的电场强度用电穿孔转染法将EGFP质粒转染入CPCs;按照不同MOI值加入rAd-EGFP,用腺病毒介导的方法使CPCs表达EGFP。24小时后在荧光显微镜下计数阳性细胞,计算转染率。用台盼蓝拒染试验观察各种条件下的不同转染法的细胞存活率。 结果改变不同的转染条件后脂质体转染的效率无明显改变,平均转染率低于2%,但对细胞的存活不产生明显的影响;增加电穿孔的电压后,转染率在一定的电压范围内明显上升,在电压强度为250V时达到最高,平均转染率为24.7%,但是细胞存活率相对较低;腺病毒感染法的平均转导率在MOI值为250时达到高峰为52%,细胞的存活率可达到85%。 结论本部分实验结果表明脂质体转染法的转染率过低;电穿孔转染法的转染率有了大幅度的提高但细胞死亡过多;腺病毒介导的转导法兼顾了转染率和细胞存活率,是使CPCs过表达目的基因的最合适的方法。但是我们需要进一步的实验和更为详尽的实验数据来支持本结论。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R764.43

【参考文献】

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1 蔡磊;李艳;窦科峰;张巍;丁睿;赵青川;;电穿孔转染悬浮细胞条件的优化[J];中国医科大学学报;2008年04期

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本文编号：2276803