STAT3信号通路调控新生小鼠耳蜗毛细胞转分化及Pmca2突变小鼠内耳基因治疗

发布时间：2018-11-09 19:38

【摘要】：第一部分STAT3信号通路调控耳蜗毛细胞转分化目的：由于衰老、噪音和耳毒性药物导致的毛细胞不可逆损伤和缺失凋亡是致人类听力下降和平衡功能障碍的主要因素,听力下降已经是美国老年群体发病率第三高疾病。哺乳动物毛细胞的不可再生性是耳聋治疗困境之一,通过刺激毛细胞再生来重建听觉器官结构和功能是治疗听力损失的理想选择。小鼠耳蜗基底膜体外培养模型是研究毛细胞再生简单有效的手段。在促进毛细胞再生药物筛选过程中发现一种STAT3信号通路激活剂SD19可以促进P0/1阶段CD1小鼠耳蜗毛细胞数目增多,进一步研究表明其机制为促进支持细胞转分化。本研究在小鼠耳蜗基底膜体外培养体系应用此种化合物,以期探索STAT3通路在哺乳动物耳蜗毛细胞再生中作用及机制,从而为哺乳动物听觉上皮毛细胞再生提供研究新方向,为药物促进毛细胞再生提供理论依据。方法： 1)探索新生CD1小鼠耳蜗基底膜和螺旋韧带体外共培养的模型,摸索不破坏毛细胞和支持细胞存活的培养条件,进一步探索不同浓度STAT3通路激活剂SD19对毛细胞影响； 2)在不同年龄段新生CD1小鼠耳蜗基底膜和螺旋韧带体外共培养的模型中使用STAT3通路激活剂SD19,探索STAT3通路在不同发育阶段耳蜗中作用； 3)研究在正常CD1小鼠和新霉素损伤毛细胞不同情况下,STAT3通路激活剂SD19的作用； 4)在新生CD1小鼠耳蜗基底膜培养模型中联合使用STAT3通路抑制剂,进一步确定STAT3通路作用； 5)在新生CD1小鼠耳蜗基底膜培养模型中利用FM1-43标记原始耳蜗毛细胞,再使用STAT3通路激活剂SD19,探究新生毛细胞的来源； 6)使用培养的Sox-2CreER+/-tdTomato转基因鼠来研究新生毛细胞来源,培养基中加入Tomaxifen激活Cre从而所有的支持细胞表达Tomato,观察新生毛细胞是否是支持细胞来源； 7)研究CD1小鼠耳蜗基底膜培养模型中使用STAT3通路激活剂SD19之后相关基因表达的变化。结果： 1)4μM和8μM的STAT3通路激活剂SD19可以明显增加新生P0/1阶段CD1小鼠顶圈和中圈耳蜗毛细胞数目,所有浓度对P3、P5阶段耳蜗毛细胞没有明显效果。新霉素损伤和正常处理均未见有Edu阳性细胞,毛细胞数目没有明显改变。联合使用STAT3抑制剂则未见毛细胞增多。在应用STAT3通路激活剂SD19之后可以发现更多FM1-43阴性而Myo7a阳性细胞,进一步证明新生毛细胞产生。Lineage tracing结果表明新生毛细胞是支持细胞起源。 2)P0阶段CD1小鼠耳蜗基底膜培养模型中加入8μM的STAT3通路激活剂SD19可以上调Stat3和JaM基因来激活STAT3通路,同时上调Hesl基因、Mathl基因、抑制Notch基因,提示增多的毛细胞来自于转分化。结论：通过本研究,证实了STAT3通路在小鼠新生耳蜗毛细胞转分化过程中发挥作用,激活STAT3通路可以促进支持细胞向毛细胞转分化。STAT3通路对Notch通路有一定的调控作用。第二部分Pmca2突变小鼠的内耳基因治疗目的： NIDCD数据表明17%美国成人患有听力下降,其中由上百种基因突变引起的遗传性耳聋目前没有治疗方法。内耳的外源性基因的导入和基因治疗,为耳聋的治疗带来了新的手段。腺病毒及腺相关病毒是内耳基因治疗常见的载体,但不同亚型可以转染不同类型细胞。Pmca2是外毛细胞纤毛上钙通道ATP酶,其功能缺陷则导致钙离子在胞内蓄积,最终造成听力丧失。无论是纯合还是杂合型成年Pmca2基因突变小鼠均表现为重度耳聋。首先筛选能够特异性转染毛细胞的病毒,然后体外克隆Pmca2基因,将外源性Pmca2基因导入新生Pmca2突变鼠内耳,通过干预遗传性耳聋动物模型毛细胞基因来表达探索从基因水平治疗遗传性耳聋。方法： 1)使用纳升2010显微操作注射系统,向小鼠中圈附近中阶注射携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein EGFP)的6种不同血清型的AAV(AAV2.2-CMV-eGFP,A-AV2.2-CASI-eGFP,AAV2.8-CMV-eGFP,AAV2.8-CASI-eGFP,AAV2.9-CMV-eGFP,AAV2.9-CASI-eGFP)和1种携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein EGFP)腺病毒(Ad5-CMV-GFP),在内耳注射3d,5d,1w,2w,lm后取双侧耳蜗标本做基底膜铺片,观察EGFP或GFP表达情况； 2)将能够转染毛细胞的AAV2.8-CMV-eGFP,AAV2.9-CMV-eGFP显微注射入新生野生型小鼠(P0/P1)右侧耳蜗中圈附近中阶,6w后使用ABR和DPOAE评价双侧听力； 3)克隆Pmca2质粒,并分别包装进／kAV2.8-CMV和Ad5-CMV-GFP病毒； 4)用Lipofectamine2000转载Pmca2质粒转染Cos7细胞系,AAV2.8-CMV-Pmca2-HA和Ad5-CMV-Pmca2-GFP转染Cos7细胞系,通过免疫组化和Western Blot评价病毒的功效； 5)在新生的Pmca2突变小鼠(P0-P1)右侧中阶注射AAV2.8-CMV-Pmca2-HA或Ad5-CMV-Pmca2-GFP0.3和0.6μL,在注射后的1w、6w分别取双侧耳蜗标本做基底膜铺片,并在6w使用ABR和DPOAE评价双侧听力。结果： 1)新生鼠在中阶注射后1w后,AAV2.8-CMV-eGFP和AAV2.9-CMV-eGFP以及Ad5-CMV-GFP组可见支持细胞、毛细胞、螺旋韧带、螺旋神经节、前庭感觉细胞表达GFP,至少持续表达2m以上； 2)野生型新生鼠中阶注射AAV2.8-CMV-eGFP和AAV2.9-CMV-eGFP,6w后,相比对侧耳,注射耳听力下降0-15dB； 3)Pmca2质粒可以通过与Lipofectamine2000形成脂质体转染Cos7细胞系并产生Pmca2蛋白,AAV2.8-CMV-Pmca2-HA不能转染Cos7细胞系,Ad5-CMV-Pmca2-GFP转染并表达Pmca2基因； 4)新生Pmca2基因突变小鼠(P0-P1)中阶注射入AAV2.8-CMV-Pmca2-HA不能检测到HA标记； 5)Ad5-CMV-Pmca2-GFP之后,1w后基底膜铺片免疫组化结果表明Pmca2在毛细胞表达,但6w后听力无明显改善,免疫组化结果表明部分少数细胞表达Pmca2。结论： 1)采用经中阶入路显微注射5型腺病毒携带目的基因导入新生鼠能够将目的基因成功转染至耳蜗组织并表达； 2)采用经中阶显微注射AAV2.8-CMV-eGFP和AAV2.9-CMV-eGFP携带目的基因导入新生鼠能够将目的基因成功转染至耳蜗组织并表达,并且新生鼠只有轻微的听力下降； 3)腺相关病毒对耳蜗毛细胞没有毒性,并最少可以有效转染两个月,但其包装能力有限,腺病毒对毛细胞有一定毒性； 4)腺相关病毒的包装能力有限,无法完全包装Pmca2基因; 5)腺病毒可以运载外源性Pmca2在小鼠耳蜗毛细胞表达,但能否使Pmca2突变鼠功能恢复还有待研究；
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R764.43

【参考文献】