超声微泡介导RB94基因转染鼠视网膜母细胞瘤的实验研究

发布时间：2018-11-10 21:38

【摘要】：研究背景及目的视网膜母细胞瘤是婴幼儿最常见的眼内恶性肿瘤。目前的治疗方式有眼球摘除术及眼眶内容摘出术、冷凝术、外部放射治疗、巩膜表面敷贴治疗、经瞳孔温热疗法、光动力学治疗等。近20年对RB的治疗有长足进步,基因治疗正处于研究阶段。微泡造影剂可作为一种基因转移载体,在声像图的监控下进行超声辐照,微泡能够在指定部位“爆破”,释放所携带的基因。本文通过体内实验研究超声微泡造影剂携带RB94基因对鼠视网膜母细胞瘤进行转染的效率及探讨RB94基因对鼠视网膜母细胞瘤的作用效果。 第一部分视网膜下注射与玻璃体腔注射建立视网膜母细胞瘤动物模型的比较 方法Rb细胞取HXO-Rb44细胞系,培养于含10%胎牛血清的改良型RPMI-1640培养基内,细胞悬液密度调至(5.0～6.0)×10~6/mL备用。30只裸鼠,分为视网膜下组和玻璃体腔组,每组各15只鼠30只眼。2组注射HXO-Rb44细胞悬液后每天裂隙灯下观察裸鼠眼内Rb肿物生长情况,并于注射后21、28、35、42 d,根据组织病理学检查统计成瘤情况,比较2组成瘤率。行Rb特异性标志神经元特异性烯醇酶(NSE)及酸性钙结合蛋白(S100)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫组织化学检测。 结果视网膜下组和玻璃体腔组在注射后均观察到肿瘤在裸鼠眼内生长并逐渐增大。注射后21、28、35、42 d,视网膜下组成瘤率高于玻璃体腔组成瘤率,差异均有统计学意义(P0.05)。免疫组织化学染色提示,Rb细胞质NSE表达较强,S100表达较弱,GFAP表达最弱。 结论在同等条件下建立Rb动物模型,视网膜下注射的成瘤率高于玻璃体腔内注射者,且视网膜下注射建立的是原位肿瘤模型,生物学行为更接近临床。 第二部分超声微泡介导RB94基因转染鼠视网膜母细胞瘤与传统转染方法效率的比较 方法第二部分在第一部分实验的基础上,将32只BALB/C(nu/nu)裸鼠双眼视网膜下接种HXO-Rb_(44)细胞,将造模成功的裸鼠随机分为6组:①空白对照组;②空白微泡+超声组;③RB94质粒+微泡组;④RB94质粒+脂质体组;⑤空质粒+微泡+超声组;⑥RB94质粒+微泡+超声组。超声组每天以0.5W/cm~2超声波辐照眼球60s,工作时间控制为20%(即辐照4s,间隔24s,共用时间60s),转染7天后,处死动物,摘除眼球,用逆转录PCR检测RB94 mRNA表达。 结果RB94质粒+微泡+超声组和RB94质粒+脂质体组在治疗7天后,肿瘤组织中RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳可明显见到418bp条带,其中RB94质粒+微泡+超声组表达较RB94质粒+脂质体组强,二者差异有统计学意义(P 0.05)。 结论浓度适当的微泡在优化的声强条件下,可获得RB94基因对裸鼠视网膜母细胞瘤较高的转染效率。 第三部分RB94基因转染后对鼠视网膜母细胞瘤生长活性的影响 方法第三部分与第二部分同时进行,将32只BALB/C(nu/nu)裸鼠双眼视网膜下接种HXO-Rb_(44)细胞,将造模成功的裸鼠随机分为6组:分组及转染方法同第二部分,用Western-blot法检测各组肿瘤组织VEGF、MICA、MICB表达情况。 结果RB94质粒+脂质体组和RB94质粒+微泡+超声组VEGF蛋白表达明显低于其他四组,而这两组中RB94质粒+微泡+超声组VEGF蛋白表达最低,二者差异有统计学意义(P0.05)。RB94质粒+脂质体组和RB94质粒+微泡+超声组MICA和MICB蛋白表达明显高于其他四组,而这两组中RB94质粒+微泡+超声组表达更高,二者差异有统计学意义(P0.05),但总体上各组MICB的表达要弱于MICA。 结论RB94质粒+微泡+超声组能显著抑制肿瘤组织中VEGF的表达,VEGF的活性被抑制能减缓肿瘤的生长和转移。RB94质粒+微泡+超声组能上调MICA及MICB的表达,一定程度上能增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性从而抑制肿瘤组织生长。上述结果反应出RB94基因对裸鼠视网膜母细胞瘤具有较明显的抑制作用。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R739.7

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本文编号：2323669