HSP72对大鼠青光眼模型视网膜神经节细胞和外侧膝状体神经元损伤的保护作用

发布时间：2018-11-18 21:50

【摘要】：目的 1.通过532nm二极管激光光凝Wistar大鼠角膜缘血管网,造成眼压升高,评价该模型的稳定性和可靠性。 2.观察大鼠慢性高眼压模型试验眼RGCs和LGN神经元中HSP72的表达情况,与利用不同方法调节HSP72的表达水平相比较,了解HSP72表达改变后是否对RGCs和LGN具有保护作用。 3.观察不同HSP72表达状态下,试验眼RGCs和LGN神经元中SAPK/JNK通路的活化情况；并与SAPK/JNK通路抑制剂sp600125的作用相比较,探讨HSP72调控青光眼神经损伤的机制。方法 1.使用532nm二极管激光光凝Wistar大鼠的角膜缘血管网。30只Wistar大鼠按光凝前,光凝后3天、7天、14天和28天5个不同时间点分为5组,每组6只,利用Tonopen-XL眼压计于处死前测量眼压；每组又分为2个亚组,第一个亚组大鼠3只,用于荧光金逆行标记视网膜神经节细胞并计数；第2个亚组大鼠3只,并通过HE染色观察视网膜神经节细胞及外侧膝状体的形态学改变。 2.用腹腔注射硫酸锌或槲皮素的方法诱导HSP72表达改变。动物分组：A组为高眼压组,Wistar大鼠30只；B组为硫酸锌注射组,Wistar大鼠30只,每2周重复注射一次；C组为槲皮素注射组,Wistar大鼠30只。上述三组分别于激光前和眼压升高后3天、7天、14天和28天5个不同时间点取材；每个时间点6只大鼠,每个时间点又分为3个亚组,每个亚组2只大鼠；一个亚组用于荧光金逆行标记计数视网膜神经节细胞；一个亚组用于免疫组织化学染色检测HSP72的表达水平；另一个亚组用于western blotting检测HSP72的表达水平。 3.用侧脑室注射sp600125抑制SAPK/JNK的活化。对20只大鼠行侧脑室sp600125注射,注射完毕后行激光；分别于激光前和眼压升高后3天、7天、14天和28天5个不同时间点进行检测；每个时间点4只大鼠,每个时间点又分为2亚组,每亚组2只大鼠；第一亚组用于荧光金逆行标记计数视网膜神经节细胞；第二亚组用于western blotting检测p-JNK,p-c-jun的表达情况。结果 1.通过532nm二极管激光光凝损伤角膜缘血管网成功建立了大鼠慢性青光眼模型,激光处理前试验眼平均眼压为13.34±0.52mmHg,空白对照眼平均眼压为13.16±0.3 mmHg；激光处理后3天,7天,14天和28天,试验眼平均眼压分别为22.04±1.08 mmHg,28.84±1.38 mmHg,30.58±1.15 mmHg和：30.56±1.01mmHg；对照眼平均眼压无明显变化。激光处理前试验眼与对照眼眼压差异无统计学意义(P=0.54),激光处理后各时间点试验眼较对照眼平均眼压明显升高,差异有极显著统计学意义(P0.01)。随着高眼压持续时间的延长,视网膜神经节细胞逐渐出现胞体空泡化,胞核固缩,核碎裂以及细胞溶解；神经纤维层和内外核层逐渐变薄,内外核层核排列紊乱,数目减少。长时间的高眼压会引起外侧膝状体神经元胞体水肿,胞核固缩,轴突减少以及轴突走向紊乱。视网膜铺片RGCs计数平均为：眼压升高前197.42±63.78个/视野,眼压升高后3d组169.5±64.71个/视野,眼压升高后7天组138.25±34.71个/视野,眼压升高后14天组113.08±39.63个/视野,眼压升高后28天组99.42±27.27个/视野；对照眼RGCs计数为：眼压升高前198±63.17个/视野,眼压升高后3天组194.67±64.14个/视野,眼压升高后7天组196.67±67.90个/视野,眼压升高后14天组194.83±69.6个/视野,眼压升高后28天组199.42±27.27个/视野；激光处理后各时间点试验眼RGCs计数较对照眼明显减少(P0.05)。 2.眼压升高前,试验眼视网膜组织中未检测到显著的HSP72的表达；眼压升高3天后RGCs中HSP72的表达达高峰,14天仍然可检测到HSP72的表达,28天后基本下降到稍高于正常眼的表达；眼压升高3天后,LGN神经元中也可以检测到HSP72的表达,但表达高峰较RGCs晚,大约在7天达高峰,28天亦回到基线水平；硫酸锌注射组RGCs和LGN神经元各时间点HSP72的表达均高于试验眼；槲皮素注射组RGCs和LGN神经元各时间点HSP72的表达均显著低于试验眼。视网膜铺片RGCs计数平均为：硫酸锌注射组,眼压升高前198.83±70.07个/视野,眼压升高后3天组173.75±58.44个/视野,眼压升高后7天组146.92±31.8个/视野,眼压升高后14天组129.67±29.49个/视野,眼压升高后28天组120±24.8个/视野；槲皮素注射组,眼压升高前199.58士66.44个/视野,眼压升高后3天组163.5士67.57个/视野,眼压升高后7天组120.92士47.12个/视野,眼压升高后14天组96.25士42.82个/视野,眼压升高后28天组80.75士44.7个/视野。激光处理前各时间点之间RGCs计数差异无统计学意义(P0.05)；激光处理后各时间点,空白对照组,试验组,硫酸锌注射组和槲皮素注射组四组两两比较皆有显著差异(p0.05)。 3.试验组,硫酸锌注射和sp600125注射组外侧膝状体神经元均可检测到SAPK/JNK信号通路中p-JNK和其下游的p-c-jun表达的增高；三组p-JNK的表达在各个时间点没有显著差异(P0.05)；而硫酸锌注射组和sp600125注射组高眼压眼视神经投射的外侧膝状体区的p-c-jun表达,较试验组高眼压眼有明显的下降(p0.05)。sp600125注射组RGCs平均计数为：眼压升高前199.58士66.44个/视野,眼压升高后3天组178.5士37.65个/视野,眼压升高后7天组156.92士37.32个/视野,眼压升高后14天组136.34士52.67个/视野,眼压升高后28天组134.75士54.2个/视野；各时间点sp600125注射组RGCs计数均高于硫酸锌注射组,差异有统计学意义(p0.05)。结论 1.经532nm二极管激光光凝损伤角膜缘血管网引起眼压升高可建立慢性青光眼模型,能够造成明显的视网膜神经节细胞损伤和丢失；并可引起LGN神经元的损伤。 2.眼压升高和硫酸锌腹腔注射会诱导RGCs和外侧膝状体神经元HSP72表达上调,硫酸锌诱导的HSP72高表达可减少RGCs的死亡率。 3.HSP72在RGCs和外侧膝状体神经元中通过阻断凋亡通路SAPK/ JNK的活化,发挥对青光眼视网膜神经路神经元的保护作用。
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【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R775

【参考文献】