慢病毒介导GAP-43基因修饰骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠视神经损伤的实验研究

发布时间：2018-11-24 11:18

【摘要】：视神经损伤是眼科临床常见的眼外伤，严重者常导致视力永久性的丧失，是重要的致盲性眼病之一。目前临床上治疗本病主要以药物为主，如伤后给予大剂量激素的冲击治疗等，但治疗效果不明显，视力恢复程度较差，而且副作用较多，因此视神经损伤的视力恢复成为眼科界难以攻克的命题，寻找一种有效的治疗方法备受眼科学者的关注。视神经损伤的病理学研究证实视神经损伤后的主要病理改变是视网膜神经节细胞(RGCs)轴索发生溃变，轴浆运输障碍导致的视网膜神经节细胞的水肿和凋亡。因此，促进视神经损伤再生的首要条件为RGCs的存活，研究神经节细胞的相关凋亡机制并选择合适的方法对凋亡加以抑制是其存活的先决条件。国内外对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的研究已经趋于白热化，对其在各种诱导条件下分化成不同的细胞，通过移植治疗不同的疾病兴趣不减，但应用在眼科方面的研究报道不多。GAP-43是一种神经生长的相关蛋白，与神经发育与再生密切相关。本研究将GAP-43与骨髓间充质干细胞这两者热门研究结合到一起，通过建立了大鼠的视神经损伤模型，探究慢病毒介导GAP-43基因转染骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠视神经损伤的可行性。第一部分构建慢病毒介导的GAP-43过表达及抑制表达载体目的：构建慢病毒介导的GAP-43过表达及抑制表达载体，并在293T细胞中测定病毒滴度。方法： 1、慢病毒介导的GAP-43过表达载体的构建以pCDNA-GAP-43为模板，设计含NotI和NsiI酶切位点的上下游引物，将扩增的PCR产物和慢病毒载体LV5双酶切，将酶切产物以T4连接酶连接。感受态细胞转化后挑选正确的克隆酶切鉴定，经测序证实表达载体构建正确。应用Lipofectamine2000三质粒系统包装慢病毒共同转染293T细胞，72h后收获病毒离心过滤，最后超速离心将沉淀重悬得到病毒储存液，测定病毒滴度。2慢病毒介导的shmRNA-GAP-43载体的构建构建针对靶基因的四个干扰质粒（Gap43-rat-619、Gap43-rat-844、Gap43-rat-1215、Gap43-rat-678）把这四个都有特定抗性表达序列的干扰质粒分别与前期构建的GAP-43过表达载体共转染293T细胞，选择出干扰效果最佳的质粒，然后构建慢病毒shmRNA-GAP-43克隆载体；用构建的慢病毒克隆载体和包装质粒共转染293T细胞，包装病毒，收集病毒原液，超速离心浓缩，并测定滴度。结果： 1、经酶切和测序鉴定慢病毒过表达载体LV5-GAP-43序列正确。293T细胞包装后收获了病毒储存液，病毒滴度为2*108TU/ml。2、干扰载体在293T细胞中的干扰结果提示Gap43-rat-619干扰效果最佳，经酶切和测序鉴定慢病毒抑制表达载体LV3-GAP-43-shRNA序列正确。经过293T细胞包装后收获了病毒储存液，病毒滴度为2*108TU/ml。结论：成功构建GAP-43基因的过表达及抑制表达的慢病毒载体，并包装产生了慢病毒，在293T细胞中内证实了病毒滴度的高效性。第二部分慢病毒介导的GAP-43基因转染骨髓间充质干细胞表达的实验研究目的：大鼠骨髓间充质干细胞的培养及鉴定。将携带GAP-43基因的慢病毒转导至BMSCs，检测其过表达水平及细胞形态学变化。方法：单纯贴壁法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞，倒置显微镜观察细胞生长形态，流式细胞学检查骨髓间充质干细胞标志抗原的表达青况。携带GAP-43的慢病毒以MOI=20感染BMSCs后，利用qPCR及Western blot检测GAP-43表达水平。观察GAP-43基因转染后BMSCs形态学变化，行RT-PCR检测NSE、nestin、NF、β Ⅲ-tubulin mRNA的表达情况。结果：培养的BMSCs为多角形或梭形，呈漩涡状排列生长。流式细胞学检查细胞表面标志抗原CD90、CD44高表达，而CD11b、CD34低表达情况。GAP-43-BMSCs经qPCR和Western blot检测证实有外源性GAP-43表达。GAP-43基因转染后BMSCs3天，BMSCs胞体开始收缩，折光性增强，细胞有突起伸出，5天时可见典型的神经样细胞形态改变，RT-PCR检测NSE、nestin、NF、β Ⅲ-tubulin mRNA表达阳性。结论：采用单纯贴壁法可在体外成功地分离、培养和纯化大鼠BMSCs。慢病毒介导的GAP-43能高效感染BMSCs，，并随着时间延长分化成神经样细胞。第三部分抑制GAP-43基因表达后骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的研究目的：抑制GAP-43基因表达后骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化研究方法：应用慢病毒介导的GAP-43-shRNA转染骨髓间充质干细胞，确定特异性筛选药物嘌呤霉素的浓度，利用qPCR及Western blot检测GAP-43表达水平。观察视网膜条件分化液条件下shmRNA-GAP-43基因转染后BMSCs形态学变化，行RT-PCR检测NSE、nestin、NF、β Ⅲ-tubulin mRNA的表达情况。结果：慢病毒介导的GAP-43-shRNA转染骨髓间充质干细胞，在视网膜条件分化液诱导条件下，qPCR和Western blot检测GAP-43、NSE、nestin、NF、β Ⅲ-tubulinmRNA的表达，GAP-43-shRNA组较阴性对照组（BMSC组）GAP-43的表达明显减少，差异有统计学意义（p0.05）。结论：抑制GAP-43基因后BMSCs向神经样细胞分化的能力被明显减弱。第四部分慢病毒表达载体介导GAP-43基因修饰骨髓间充质干细胞修复大鼠视神经损伤的实验研究目的：观察慢病毒表达载体介导GAP-43基因修饰骨髓间充质干细胞修复大鼠视神经损伤的作用及其相关机制，期望为视神经损伤治疗提供新思路，探索一条新途径。方法：采用钳夹视神经法建立大鼠视神经损伤模型。120只大鼠随机均分为假手术组（Sham组）、溶剂对照组（PBS组）、空载慢病毒组（GFP/BMSCs组）、GAP-43重组慢病毒组（GAP-43/BMSCs组）和shRNA-GAP-43/BMSCs重组慢病毒组（shRNA-GAP-43/BMSCs组），每组24只，按术后3天、7天、14天、28天均分为4个亚组，将5ul1×PBS溶液或1×105/眼细胞数注射到视网膜下腔。HE染色观察细胞移植后视网膜病理变化。采用Western-blot检测各实验组大鼠视网膜GAP-43蛋白表达，Realtime PCR检测视网膜组织GAP-43mRNA表达变化。结果：在视神经损伤模型建立后第3、7、14、28日，GAP-43/BMSCs组的视网膜病理改变均明显轻于其他各组。此外，与sham组，PBS组、GFP/BMSCs组、shRNA-GAP-43/BMSCs组相比，GAP-43/BMSCs组视网膜组织GAP-43基因的mRNA及蛋白表达表达上调，差异均有统计学意义（P㩳0.05）。结论：成功构建大鼠视神经损伤模型。慢病毒介导的GAP-43转染BMSCs移植到视网膜下腔可以高效表达GAP-43基因，在神经修复过程中起到了一定的作用。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R779.1

【参考文献】