抑制p38MAPK信号通道调控结膜下纤维化反应的研究

发布时间：2018-11-25 20:05

【摘要】：滤过性手术仍是目前眼压不能控制的青光眼的主要治疗手段。术后滤过通道的瘢痕化导致术后2年的手术失败率达15%～25%。影响滤过通道瘢痕化的危险因素有多种,包括年轻人、滤过手术史、术前长期使用有防腐剂的滴眼液、伴葡萄膜炎、眼前段新生血管形成等病史。各种原因导致滤过手术失败的共同点是滤过通道的成纤维细胞过度增殖,导致过度纤维化反应、瘢痕形成。其细胞学基础就是在TGF-β为主的细胞因子介导下,成纤维细胞转化为肌成纤维细胞,并合成过量的胶原蛋白等细胞外基质。最近的研究发现,p38 MAPK信号通道在成纤维细胞表型转化过程中起着重要的作用。本研究初步观察了抑制p38 MAPK信号通道对兔小梁切除术后纤维化反应的作用,说明p38MAPK信号通道可作为新的抗瘢痕化作用靶点；在体外培养了人Tenon's囊成纤维细胞,证实了p38 MAPK信号通道参与了TGF-β1诱导下的成纤维细胞向肌成纤维细胞分化；设计、合成了特异性沉默p38 MAPK表达的siRNA,初步探讨了RNA干扰p38 MAPK信号通道对TGF-β1诱导下成纤维细胞增殖、表型转化的抑制作用。一、抑制p38 MAPK信号途径对兔小梁切除手术后纤维化反应的作用目的：观察p38 MAPK抑制剂SB203580对兔小梁切除术后纤维化反应的作用。方法：将12只兔24眼随机分为3组：A组(单纯小梁切除术组)、B组(小梁切除术+SB203580组)、C组(小梁切除术+MMC组)。对各组进行裂隙灯显微镜观察、眼压检查、滤过区结膜组织学和透射电镜观察、免疫组织化学法检查滤过区α-SMA表达、Elisa检测房水及滤过区结膜组织的α-SMA、纤维连接蛋白含量、荧光实时定量PCR检测各组术区结膜组织ACTA2、CTGF、COL1A2的mRNA表达。结果：术后14天A组滤过泡血管化、瘢痕形成,B组滤过泡扁平弥散,C组滤过泡苍白缺血状、扁平弥散。不同时间点各组之间眼压无明显差异。滤过泡组织学及透射电镜观察检查可见不同组间结膜上皮细胞、成纤维细胞和上皮下纤维组织形态不同。免疫组织化学法观察见A组纤维组织间大量的棕黄色α-SMA阳性细胞,B、C组阳性细胞数量减少。Elisa检测各组房水及结膜的α-SMA及FN的含量差异有统计学意义,荧光实时定量PCR检测各组结膜组织ACTA2、CTGF、COL1A2的mRNA表达差异有显著性,各指标均为A组最高,B组次之,C组最低。结论：p38 MAPK抑制剂SB203580能减轻兔小梁切除术后纤维化反应,抑制p38MAPK信号通道可作为新的抗瘢痕化途径。二、体外培养人Tenon's囊成纤维细胞及诱导表型转化目的：体外培养和鉴定人Tenon's囊成纤维细胞(Human Tenon's Fibroblast, HTF),观察TGF-β1诱导的HTF表型转化特征。方法：取材人Tenon's囊组织,组织贴块法培养传代。倒置显微镜观察HTF形态特点,免疫组织化学法波形蛋白及角蛋白染色鉴定细胞来源,细胞计数法绘制生长曲线。Western Blot检测TGF-β1刺激下的信号通道蛋白p38MAP、Smad2的变化,荧光实时定量PCR检测肌成纤维细胞分化标志α-SMA、CTGF、COL1A2的nRNA表达,Elisa检测α-SMA和纤维连接蛋白的含量,流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：显微镜下可见细胞呈长梭形或多突起的星形,贴壁生长。免疫组织化学染色波形蛋白为阳性,角蛋白阴性。生长曲线表明培养第2-8天为对数生长期。TGF-β1刺激使p38 MAPK、Smad2信号通道活化,ACTA2、CTGF、COL1A2 mRNA表达增强,α-SMA和纤维连接蛋白的含量增加,细胞凋亡减少。结论：通过人Tenon's囊组织贴块培养可获得生长稳定、成分纯净的HTF。TGF-β1刺激可促使成纤维细胞增殖、分化,合成细胞外基质,p38 MAPK信号途径参与了这个过程。三、沉默p38 MAPK表达的siRNA对TGF-β1诱导下的人Tenon's囊成纤维细胞的作用目的：设计合成p38 MAPK siRNA,筛选获得高效、特异的siRNA,观察沉默p38MAPK表达对TGF-β1诱导下的HTF增殖和表型转化的抑制作用。方法：设计、合成三对靶向p38 MAPK的siRNA,(?)日离子脂质体lipofectamine 2000转染体外培养的HTF,采用Western blot测定p38 MAPK表达抑制情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,MTT法检测细胞活力筛选出最佳siRNA。以筛选出来的siRNA体外转染HTF,同时设对任何基因无作用的siRNA作为阴性对照。TGF-β1刺激下,Westernblot观察p38MAPK、Smad2信号通道改变,荧光实时定量PCR检测ACTA2、CTGF、COL1A2的mRNA表达,Elisa检测α-SMA和纤维连接蛋白的含量,MTT法测定细胞活力,原子力显微镜观察细胞形态及超微结构。结果：siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3对p38 MAPK的抑制率分别为71.01%、68.65%、86.87%,与单纯TGF-β1刺激的凋亡率差分别为2.01%、1.72%、3.59%。三种siRNA对细胞活力抑制作用差异无显著性。转染p38 MAPK siRNA-3后,TGF-β1诱导的p38MAPK的表达显著降低,Smad2信号通道先下降后升高趋势,差异具有显著性：明显减少了ACTA2、CTGF、COL1A2的mRNA表达,降低了α-SMA、FN的浓度,差异有统计学意义。转染后TGF-β1刺激的时间因素与ACTA2、CTGF、COL1A2的mRNA表达存在交互作用,时间因素与α-SMA、FN的含量有交互作用,并且这种交互作用呈线性或二次项趋势。转染后TGF-β1刺激下的细胞活力被明显抑制。RNA干扰p38 MAPK对成纤维细胞形态及超微结构有明显影响。结论：设计合成的三种siRNA均具有p38 MAPK基因沉默效果,其中以siRNA-3效果最佳。靶向沉默p38MAPK表达的siRNA能有效抑制TGF-β1诱导的HTF增殖和表型转化。
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【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R779.6

【参考文献】