真菌性角膜炎修复过程中相关分子的表达变化及角膜新生血管芯片分析

发布时间：2018-11-28 09:19

【摘要】：目的：研究小鼠白色念珠菌角膜炎修复过程中基质金属蛋白酶及其抑制因子、胶原纤维及其他修复相关分子的动态变化，借以了解真菌性角膜炎发病过程中角膜损伤修复的分子机制。方法：选用6-8周C57BL/6小鼠，采用角膜基质注射法注射0.5μl 1×10~8 CFU/ml的真菌孢子于角膜基质诱导白色念珠菌性角膜炎，于感染后数天裂隙灯持续观察角膜变化情况，并于第1、3、5、7、9、11、14天，取小鼠眼球作组织病理学检查，观察角膜形态的变化，炎性细胞的浸润及真菌的生长情况；同时，，应用实时定量PCR技术检测取小鼠角膜中基质金属蛋白酶及其抑制因子（MMPs，TIMPs）、趋化因子（MCP-1，MIP-2）、胶原纤维（Col1a1、Col3a1和Col4a1）及MXRA-7等分子基因表达水平的变化；应用免疫荧光技术进一步验证感染后1天小鼠角膜中炎性细胞的浸润情况。结果：小鼠角膜基质注射白色念珠菌孢子后感染了严重的角膜炎，裂隙灯显微镜连续观察可见小鼠角膜形态由感染前期的水肿、溃疡逐渐趋向自愈，最终仅在病变处留下斑翳；感染后第1、3天角膜PAS染色，发现基质内存在大量真菌孢子及菌丝，HE染色可见感染后第3天大量浸润的炎性细胞及第11天大量活化的成纤维细胞。RT-qPCR检测发现大多数基因表达水平存在动态变化，其中，MIP-2、MCP-1、MMP-13及TIMP-1于感染后迅速升高，第1天即达高峰；MMP-3、8、9、10、12分别于感染后的第3天或第5天达高峰，然后均逐渐下降。MMP-2、TIMP-2、Col1a1、Col3a1和Col4a1在感染后逐渐升高，至第11天表达量达高峰；然而MXRA-7的表达趋势与其他分子相反，于感染后迅速下调，随后表达量又逐渐恢复。HE及免疫荧光可见感染后1天中性粒细胞由角巩膜缘向病变部位聚集。结论：白色念珠菌角膜炎过程中，不同的修复相关分子表现出相同或不同的变化趋势，提示各种分子可能来源于不同的细胞并发挥着不同的功能。它们的作用机制及相互作用还需进一步研究。目的：缝线、碱烧伤是诱导炎性角膜新生血管模型常用的两种方法。本研究主要比较两种方法诱导的小鼠角膜新生血管发生早期全基因组的表达变化。方法：选用6-8周Balb/c小鼠，建立缝线及碱烧伤诱导的小鼠角膜新生血管模型；分别于两种模型新生血管生长初期（缝线第5天，碱烧伤第6天）观察新生血管的生长情况，同时收取小鼠眼球或角膜，用于后期组织病理学检查或基因微阵列检测。芯片数据经标准化及表达筛选后，应用SAM软件（Significance Analysis ofMicrooarrays）行统计学分析；挑选出的差异基因用DAVID（the Database forAnnotation, Visualization, and Integrated Discovery）数据库进行功能注释。结果：裂隙灯下观察可见缝线诱导的角膜新生血管生长于角巩膜缘与缝线之间，角膜中央无血管区的透明性并不受影响；而碱烧伤导致整个角膜的水肿及透明性的丧失。组织病理学显示缝线仅导致了局部上皮缺损及角巩膜缘与缝线间角膜组织的炎性浸润，而碱烧伤损坏了角膜中央整个上皮层并引起大量的炎性细胞浸润。基因微阵列数据分析发现，缝线第5天，共有1055个差异表达的探针（其中有586个探针上调，469个探针下调）；碱烧伤第6天，共有861个差异表达的探针（其中有472个上调，389个下调）。在两种模型所有的差异表达探针中，有一大部分探针（总共530个，包括286个上调和244个下调探针）的表达变化趋势是相同的。应用DAVID数据库对两种模型共同差异的基因进行功能注释，发现共同上调的基因主要富集于“趋化性”及“免疫反应”等GO（Gene Ontology）中，而共同下调的基因主要富集于“氧化还原”及“程序化细胞死亡”的GO中。同时，一些在角膜新生血管及相关疾病中从未报道过的基因及基因家族，例如S100家族或α，β，γ晶体蛋白家族，也出现在了差异变化基因之列。结论：缝线、碱烧伤造成的角膜损伤不同程度的影响了角膜的透明性。基因微阵列分析显示两种模型中差异基因的表达变化趋势具有一致性。进一步研究微阵列中新发现的差异表达基因，将会扩充对新生血管发病机制的认识。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R772.21

【共引文献】