脂肪来源干细胞复合脱细胞真皮基质微粒修复声带急性损伤的实验研究

发布时间：2018-12-28 07:47

【摘要】： 声带固有层细胞外基质成分是声带正常振动的基础,其损伤后固有层细胞外基质的组成及分布发生变化,大量纤维组织增生,形成声带瘢痕,导致发音障碍,严重影响患者的生活质量。临床上,声带注射填充术在一定程度上能改善发音,但不能恢复声带固有层细胞外基质的组成及分布,也就不能实现声带的结构重建、功能恢复。近年来,组织工程技术的发展给声带损伤的修复重建带来了希望。种子细胞和支架材料的选择是目前研究的核心内容,可能对促进声带损伤修复及功能恢复具有重大意义。应用胚胎干细胞或骨髓干细胞混合胶原注入受损的声带的研究取得了一定的进展,但存在伦理限制、细胞来源少及创伤大等问题,且胶原在声带内易被吸收。脂肪来源干细胞(ASCs)体外易分离培养,来源丰富,取材简便,创伤小。脱细胞真皮基质(ADM)是天然生物材料,在体内可完全降解,对细胞和组织无毒性,是良好的细胞支架材料。本实验将兔脂肪来源干细胞与牛脱细胞真皮基质微粒复合培养后注入急性损伤的兔声带,观察其对损伤声带的修复重建效果。 1目的: 探讨rASCs-MADM复合体用于声带注射的可行性及其对声带急性损伤的修复重建效果。 2方法 2.1取兔腹股沟脂肪组织,胶原酶消化,分离培养rASCs,倒置显微镜下观察细胞形态,MTT法检测细胞生长规律,定向诱导培养鉴定细胞的多向分化潜能,并对细胞进行冻存复苏培养。 2.2无疫新鲜胎牛皮肤,机械方法去除表皮及真皮乳头层,使用网状层真皮,结合胰蛋白酶消化法-NaOH消蚀法-冻融法,制成脱细胞真皮基质,将其切割成微粒,直径约200-450μm。取DiI标记好的rASCs与制备好的MADM复合培养,荧光显微镜、扫描电镜观察细胞黏附材料情况,MTS比色法检测rASCs复合MADM后细胞增殖情况。复合体培养3天,与适量胶原混合后注入正常兔声带肌内,术后2、4、8w内窥镜下观察声带大体形态,并分别随即取材,冰冻切片后立即在荧光显微镜下观察rASCs在声带中存活、分布情况,HE染色观察声带组织对材料的炎症排斥反应及材料降解情况。 2.3成年雄性新西兰大白兔6只,体重2.7-3.2kg,随机分为2组。麻醉后行喉裂开暴露双侧声带,半导体激光(功率8W)损伤双侧声带膜部后1/2组织,深达甲杓肌,术后2、4w内窥镜下观察兔子双侧声带的大体形态,并随即分别取材,HE染色观察声带上皮覆盖损伤部位及固有层组织结构变化情况,Van Gieson染色观察固有层胶原排列变化。 2.4新西兰大白兔18只,体重约2.7-3.2kg,随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组,每组6只。Ⅰ组左声带注射rASCs-MADM,Ⅱ组左声带注射rASCs,Ⅲ组左声带注射MADM,各组右声带仅单纯损伤,另设3只兔子的声带为正常对照。声带急性损伤,随即进行声带注射。声带注射术后2、4、8w内窥镜下观察声带损伤修复情况,并于术后8w取材,HE染色观察声带固有层组织结构大体变化,Van Gieson染色法观察各组声带固有层胶原情况。 3结果 3.1 rASCs体外易分离培养,取材料简便,增殖能力强,在不同微环境下可分化为脂肪细胞、成骨细胞和成肌细胞,冻存复苏后的细胞仍能保持良好增殖能力。 3.2 MADM所含胶原连续性好,相互交织成立体网状结构,孔隙约20-50μm,可切割成直径200-450μm微粒,可行注射方式移植。rASCs能黏附材料上生长良好并不断增殖,与常规培养组细胞增殖能力比较,有显著差异。rASCs-MADM在兔声带内的免疫排斥反应轻微,注入8w后,可观察到有植入细胞存活和部分材料保留,说明材料生物相容性好,降解速度适当,是一种良好的支架材料。 3.3喉裂开方式进行声带损伤来建立声带急性损伤模型,损伤部位及程度明确,术后声带无明显粘连,对动物颈部损伤不大,颈部无局部并发症发生,整个操作程度简单。切片发现:2w声带粘膜上皮已覆盖损伤部位,固有层大量胶原沉积,未形成束状,4w声带损伤部位不平整,固有层胶原沉积增生继续增多,呈粗大束状,排列紊乱。 3.4声带急性损伤后即行声带注射,并于术后2、4、8w内窥镜下观察声带大体情况,结果显示:注射rASCs-MADM组、rASCs组的声带损伤部位光滑,肉芽组织形成少,而注射MADM组声带、单纯损伤组声带损伤部位表面不规则、肉芽组织形成多。HE染色、Van Gieson染色法显示,注射rASCs-MADM组、rASCs组声带固有层胶原排列连续有序,而注射MADM组胶原呈弯曲束状紧密排列,单纯损伤组胶原排列紊乱、断裂,胶原大量沉积增生。 4小结 4.1 rASCs来源丰富,取材简便,体外易分离培养,增殖能力强,能多向分化,应用前景广。 4.2 MADM制备简便,强度适中,具有良好的三维结构,生物相容性好,降解速度适当,是良好的细胞支架材料和声带注射填充材料。 4.3通过喉裂开对动物声带损伤来建立声带损伤动物模型方法可行,对动物损伤不大,操作简单。 4.4 rASCs能粘附MADM表面生长,而且MADM能明显促进细胞增殖,形成rASCs-MADM复合体,可行声带内注射。声带注入rASCs-MADM复合体,不仅对声带有填充增容作用,而且减少声带损伤后其固有层的胶原沉积,在一定程度上预防声带萎缩、瘢痕形成,取得比单纯注射干细胞或微粒有更好的修复效果。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R767

【参考文献】