唑来膦酸体外抗人鼻咽癌细胞作用研究

发布时间：2019-01-03 20:45

【摘要】：背景与目的鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)为中国华南地区常见的恶性肿瘤,放疗或联合化放疗是主要治疗手段。早期患者单纯放疗5年生存率高达80%以上,晚期患者5年生存仅25%～50%,局部复发及远处转移仍是治疗失败的主要原因,骨转移是最常见转移部位。如何有效控制远处转移、提高局部控制率是目前研究的热点。唑来膦酸属于第3代双膦酸盐类药物,在目前临床应用的双膦酸盐中具有最强的抗骨重吸收能力。在乳腺癌、前列腺癌、骨髓瘤等肿瘤细胞系中,体内外试验已证明唑来膦酸能通过抑制肿瘤细胞的增殖、分化,诱导细胞凋亡,降低肿瘤细胞的迁移、侵袭能力,抑制肿瘤新生血管形成,刺激??T淋巴细胞增殖等多种途径直接或间接发挥其抗肿瘤的作用。唑来膦酸与多种化疗药物联合比单用化疗药物可取得更好的抗肿瘤作用。已有临床研究对唑来膦酸的抗肿瘤作用仍存在争论。奥地利乳腺癌和结直肠癌研究组-12 (The Austrian Breast Colorectal Cancer Study Group Trial 12, ABCSG-12)的结果表明,唑来膦酸提高早期乳腺癌的无病生存率和无复发生存率。而英国的AZURE研究显示唑来膦酸并没有给乳腺癌患者生存获益,未能提高患者的无病生存率和总生存率。唑来膦酸对鼻咽肿瘤的临床治疗作用,以及对鼻咽癌细胞系的抗癌作用尚未有研究报道。本课题研究重点主要是通过体外实验,观察唑来膦酸对人低分化鼻咽癌HNE-1细胞系增殖、凋亡诱导,侵袭、迁移和管道形成能力的影响,并探讨相关的作用机制,为进步探索唑来膦酸治疗鼻咽癌提供理论依据。方法第一部分唑来膦酸对鼻咽癌HNE-1细胞增殖和凋亡诱导的影响: 1 MTT试验检测不同浓度唑来膦酸对HNE-1细胞的增殖抑制作用; 2流式细胞术检测不同浓度唑来膦酸对HNE-1细胞的凋亡诱导作用; 3流式细胞术检测不同浓度唑来膦酸对HNE-1细胞周期分布的影响作用; 4原位末端标记法(TUNEL)检测不同浓度唑来膦酸对HNE-1细胞凋亡诱导作用; 5实时定量聚合酶链反应(RT-Q-PCR)检测不同浓度唑来膦酸对HNE-1细胞Bcl-2、Bax、Bad和Caspase9 mRNA水平的影响; 6 Western免疫印迹法(Western Blot)检测不同浓度唑来膦酸对HNE-1细胞Bcl-2、Bax、Bad和Caspase9蛋白的影响。第二部分唑来膦酸对鼻咽癌HNE-1细胞迁移、侵袭和血管拟态形成的影响: 1 Transwell迁移实验检测不同浓度唑来膦酸对HNE-1细胞迁移能力的影响; 2 Transwell侵袭实验检测不同浓度唑来膦酸对HNE-1细胞侵袭能力的影响; 3不同浓度唑来膦酸对HNE-1细胞血管拟态形成的影响; 4明胶酶谱实验检测不同浓度唑来膦酸对HNE-1细胞MMP2、MMP9活性的影响; 5酶联免疫吸附实验(ELISA)检测不同浓度唑来膦酸对HNE-1细胞释放VEGF的影响; 6逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测不同浓度唑来膦酸对HNE-1细胞MMP2、MMP9和VEGF mRNA水平的影响; 7 Western Blot法检测不同浓度唑来膦酸对HNE-1细胞MMP2、MMP9和VEGF蛋白的影响。结果第一部分 1与唑来膦酸对照组(0?mol/L)比较,不同浓度唑来膦酸处理组(2.5?mol/L、5?mol/L、10?mol/L、20?mol/L、40?mol/L)作用24hr,对HNE-1细胞增殖无抑制作用(P0.05);作用48hr和72hr均能明显抑制HNE-1细胞增殖,其中48hr增殖抑制率分别为(3.43±2.46)%、(5.29±4.56)%、(27.25±14.97)%、(32.94±7.54)%和(38.44±11.54)%, 72hr增殖抑制率分别为(8.67±3.22)%、(11.79±0.69)%、(32.58±2.28)%、(39.95±1.95)%和(44.79±2.21)%,与对照组比较差异均有统计学意义(P0.05);但抑制增殖能力与药物浓度和作用时间未呈时效和量效关系(P0.05)。 2 FCM法检测不同浓度(0?mol/L、10?mol/L、20?mol/L、40?mol/L)唑来膦酸处理HNE-1细胞,24hr未能明显诱导细胞凋亡(P0.05);48hr早期凋亡率分别为4.0%、14.4%、14.7%和14.1%,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05);72hr早期凋亡率分别为4.5%、11.8%、11.4%和27.8%,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。 3 FCM法检测检测不同浓度唑来膦酸(0?mol/L、10?mol/L、20?mol/L、40?mol/L)作用HNE-1细胞48hr,20?mol/L、40?mol/L组HNE-1细胞的S期细胞较对照组比例升高,差异有统计学意义(P0.01);而10?mol/L组则不明显。 4 TUNEL法染色显示,凋亡细胞核呈棕褐色颗粒,细胞多呈圆形、少数形状不规则。不同浓度唑来膦酸(0?mol/L、10?mol/L、20?mol/L、40?mol/L)作用HNE-1细胞48hr,凋亡指数分别为(3.33±4.25)%、(4.45±2.56)%、(5.55±2.87)%和(5.12±3.14)%,与对照组比较差异无统计学意义(P0.05);作用72hr凋亡指数分别为(5.00±5.84)%、(11.67±3.33)%、(16.67±5.29)%和(26.11±4.92)%,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。 5 RT-Q-PCR结果显示,与对照组比较,不同浓度(1??mol/L、2??mol/L、4??mol/L)唑来膦酸处理HNE-1细胞48hr,Bad基因的表达量分别为1.77±0.10、3.04±0.24和3.52±0.06;Bcl-2基因的表达量分别为1.03±0.07、0.97±0.11和0.33±0.19;Bax基因的表达量分别为1.61±0.34、3.36±0.36和4.90±1.89;Caspase9基因的表达量分别2.59±0.12、2.63±0.14和3.39±0.52;与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。 6 Western Blot结果显示,经不同浓度唑来膦酸(0?mol/L、10?mol/L、20?mol/L、40?mol/L)处理HNE-1细胞48hr,Bax,Bad和Caspase?9的蛋白表达均有不同程度的升高,Bcl-2的蛋白表达则下降。Gel-Pro Analyzer 4.0软件分析结果显示,Bad蛋白表达的IOD值分别为606.27±34.46、414.40±3.90、1218.20±11.41和1346.00±18.70;Bax蛋白表达的IOD值分别为270.60±17.25、249.00±15.06、390.87±22.24和573.17±19.04;Caspase?9蛋白表达的IOD值分别为731.43±1.80、1595.53±21.12、1552.10±64.81和1622.80±58.60;Bcl-2蛋白表达的IOD值分别为1175.90±10.86、1246.53±41.35、343.43±9.06和158.27±6.56;与对照组比较差异均有统计学意义(P0.05)。第二部分 1不同浓度(0?mol/L、10?mol/L、20?mol/L、40?mol/L)唑来膦酸处理HNE-1细胞24hr,其迁移细胞数分别为121.80±7.09、61.60±10.29、27.80±7.89和19.80±3.35,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.01);且不同浓度组间差异也有统计学意义(P0.05),其穿膜细胞分别降低(49.80±0.56)%、(77.38±0.25)%和(82.82±1.24)%。 2不同浓度(0?mol/L、10?mol/L、20?mol/L、40?mol/L)唑来膦酸处理HNE-1细胞24hr,其侵袭细胞数分别为75.80±2.59、54.80±5.36、44.60±6.43和38.60±8.23,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.01);且不同浓度组间差异统计学上也有意义(P0.05),其穿膜细胞分别降低(28.87±1.29)%、(42.93±2.36)%和(53.69±5.13)%。 3不同浓度(0?mol/L、10?mol/L、20?mol/L、40?mol/L)唑来膦酸处理HNE-1细胞48hr,HNE-1细胞小管状结构形成的数量分别为118.0±9.85、96.00±3.61、59.66±14.36和42.33±2.23,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.01);且不同浓度组间差异也有统计学意义(P0.05)。 4明胶酶谱试验结果显示,40?mol/L唑来膦酸作用HNE-1细胞24hr,抑制MMP2和MMP9的酶活性,但10?mol/L、20?mol/L组则抑制不明显。 5不同浓度(0?mol/L、10?mol/L、20?mol/L、40?mol/L)唑来膦酸处理HNE-1细胞24hr, HNE-1细胞上清中VEGF浓度分别为(5263.86±89.17)pg/ml、(4626.16±30.26)pg/ml、(4154.65±39.65)pg/ml和(1907.76±171.38)pg/ml,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.01);且不同浓度组间差异也有统计学意义(P0.05)。 6 RT-PCR结果显示,不同浓度(0?mol/L、10?mol/L、20?mol/L、40?mol/L)唑来膦酸处理HNE-1细胞24hr,VEGF、MMP2、MMP9三者mRNA的表达均有不同程度的降低。Gel-Pro Analyzer 4.0软件分析结果显示,VEGF mRNA表达的IOD值分别为5.17±0.17、4.72±0.30、2.43±0.21和1.13±0.02;MMP2 mRNA表达的IOD值分别为4.82±0.13、4.02±0.06、3.59±0.03和2.18±0.02;MMP9 mRNA表达的IOD值分别为5.27±0.17、4.99±0.01、4.20±0.01和2.52±0.04;与对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。 7 Western Blot结果显示,不同浓度(0?mol/L、10?mol/L、20?mol/L、40?mol/L)唑来膦酸处理HNE-1细胞24hr,VEGF、MMP2和MMP9蛋白表达均有不同程度的降低。Gel-Pro Analyzer 4.0软件分析结果显示,VEGF蛋白表达的IOD值分别为2155.60±85.13、1954.33±119.14、1490.76±82.24和1116.30±75.17;MMP2蛋白表达的IOD值分别为511.58±26.27、161.33±12.60、164.87±14.12和56.41±6.03;MMP9蛋白表达的IOD值分别为353.99±22.81、184.43±7.23、93.09±6.65和43.31±5.73;与对照组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 1唑来膦酸体外能抑制人鼻咽癌HNE-1细胞增殖、诱导HNE-1细胞凋亡、干扰HNE-1细胞周期分布; 2唑来膦酸通过下调HNE-1细胞Bcl-2 mRNA和蛋白的表达,上调Bax、Bad和Caspase9 mRNA和蛋白表达,诱导其凋亡。 3唑来膦酸体外能抑制HNE-1细胞的迁移、侵袭和血管拟态形成; 4唑来膦酸通过抑制HNE-1细胞VEGF的分泌,抑制MMP2和MMP9酶活性发挥其抗迁移、侵袭和血管拟态形成作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：汕头大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R739.6

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