莱菔硫烷通过miRNA-124-3p靶向STAT3抑制鼻咽癌的增殖

发布时间：2019-01-14 07:59

【摘要】：研究背景莱菔硫烷(Sulforaphane,SF)在西兰花和芥蓝等十字花科植物中含量丰富,是常见的抗氧化剂,最近越来越多的研究表明它同时具有良好的抗肿瘤作用。一般它在肿瘤中作为化疗保护剂,它可以抑制促使前致癌物转变为致癌物的相关酶的活性,也可以增强机体排出致癌物的相关酶的活性。莱菔硫烷的抗肿瘤效应主要表现在抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞发生凋亡、阻断细胞周期和保护细胞DNA免受甲基化等方面,从而阻断或抑制肿瘤的发生、发展和转移等过程,最近也有研究表明莱菔硫烷可以特异性杀伤肿瘤干细胞。在结肠癌中,它可以通过增加cyclinA和cyclinB1的表达阻断细胞周期过程,同时还可以使磷酸酰丝氨酸蛋白发生膜外翻,染色质浓集以及其它超微结构发生修饰促使结肠癌细胞发生凋亡,另外它还可以降低5羟色胺受体的表达,保护细胞DNA免受甲基化。在肺腺癌中,它可以通过Caspase3信号促进细胞发生凋亡,并降低肺腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤率,从而抑制肿瘤的发生和发展。在乳腺癌中,它能够抑制Wnt/β-catenin信号从而杀伤肿瘤干细胞,来降低乳腺癌的生长、侵袭和转移能力。在胰腺癌中,它通过靶向抑制NF-κB诱导的抗凋亡过程来杀伤肿瘤细胞。在前列腺癌中它能够降低Notchl和Sox2以及ALDH1的活性,抑制肿瘤干细胞的分化和自我更新能力,进而降低前列腺癌的侵袭转移和复发。鼻咽癌的研究中,发现莱菔硫烷在EB病毒阳性的鼻咽癌细胞中还具有抑制EB病毒增殖分裂周期的能力,降低EB病毒的复制再生,从而在EB病毒相关的鼻咽癌中发挥重要的抗肿瘤效应。信号传导与转录激活因子(Signal Transducer and Activator of Transcription,STAT)蛋白家族成员包括STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b,和STAT6。它们是一组可以被不同细胞因子受体激活的相关蛋白,它们发生磷酸化后,聚集形成同源或异源二聚体并转入细胞核中,与相应基因的启动子区域结合,从而参与有关蛋白的调控表达。STAT3是该家族成员中的最为重要的一个,它的瞬时表达的对很多生理过程起着重要的作用,在正常情况下,它的表达和活化是严格的受机体控制的。近来发现STAT3与肿瘤关系密切,在许多肿瘤组织和细胞中均发现它存在持续性表达和活化,特别是在慢性炎症介导的肿瘤中起着重要的作用。在STAT3异常表达的肿瘤中,改变或抑制其表达水平后,肿瘤细胞的生长增殖受到抑制、细胞周期受到阻断并促进凋亡的发生,因此STAT3在肿瘤中的研究越来越受到人们的重视。STAT3两端有磷酸化位点,其中比较重要的为p-STAT3(Tyr705)和p-STAT3(Ser727),当前研究比较多是p-STAT3(Tyr705)的研究,前列腺癌的研究中表明,莱菔硫烷具有抑制p-STAT3(Tyr705)表达水平的作用。在胰腺癌中,莱菔硫烷与苄基异硫氰酸酯合用能够明显降低STAT3及其磷酸化水平。针对STAT3靶点的药物开发一直是肿瘤研究中的一个热点,而莱菔硫烷抗肿瘤效应表明,它在抑制肿瘤发生发展和转移过程中是复杂的,多步骤参与的,其很多机制还不明了。鼻咽癌中也存在STAT3的异常表达,而莱菔硫烷在鼻咽癌中对该信号通路影响还不清楚,因此有必要对此进行深入的研究。 microRNAs (miRNAs)是一类大小为16-26个碱基的小非编码RNA,它们能与r(?)RNA的3、端非编码区结合(untranslated region, UTR),从而参与转录后蛋白的表达调控。大量研究表明,miRNAs主要是通过与mRNA的3'UTR结合后,抑制蛋白翻译过程。miRNAs在肿瘤中的研究最为广泛,很多肿瘤中都发现miRNAs存在异常表达情况,而且在许多肿瘤的研究中发现,改变miRNAs的表达能够抑制肿瘤的发生发展和转移,miRNAs可能成为一个新的肿瘤治疗靶点。大量的研究表明miRNAs在肿瘤中发生发展过程中起着重要的作用,有些miRNAs充当癌基因的角色,有些miRNAs充当抑癌基因的角色,对miRNAs的研究已经成为肿瘤研究中的一个新的领域,它的发现对进一步阐明肿瘤发生、发展和转移的分子机制提供了新的理论基础。miRNA-124在很多肿瘤中发现是异常缺失的,充当抑癌基因的角色,它的异常表达对肿瘤的发生发展和转移起着重要作用。有研究表明miRNA-124可以直接靶向抑制STAT3的表达,从而抑制肿瘤的发生发展和转移。鼻咽癌中STAT3的表达也存在异常,HONE1和CNE1细胞株中STAT3的表达是上调的,而莱菔硫烷在鼻咽癌中对STAT3蛋白的具体影响机制还不是很明了,本文先是发现莱菔硫烷具有抑制鼻咽癌细胞株HONE1和CNE1细胞中STAT3的表达,紧接着又发现该过程中涉及有miRNAs表达的改变,其中miRNA-124-3p在莱菔硫烷下调STAT3过程中存在明显的上调情况。本研究以鼻咽癌细胞HONE1、CNE1、CNE2和Sunel为研究对象,观察莱菔硫烷对鼻咽癌细胞生长、凋亡、肿瘤球生长的影响情况,鼻咽癌中肿瘤干细胞标志物、STAT3以及其磷酸化水平和STAT3上游miRNAs的表达影响,研究探讨莱菔硫烷在鼻咽癌中的作用和其可能的分子机制,为鼻咽癌的预防和药物的开发提供一定的理论基础。研究方法 1、查阅相关文献,确定鼻咽癌细胞株HONE1、CNE1、CNE2和Sunel为研究对象,检测莱菔硫烷对HONE1和CNE1的生长抑制情况：通过MTT实验检测莱菔硫烷对两株鼻咽癌细胞作用48小时后的细胞生长存活情况,并分别计算两株细胞的半数抑制浓度(half inhibitory concentration, IC50)。 2、不同浓度莱菔硫烷对鼻咽癌细胞凋亡情况的影响：在HONE1和CNE1细胞上,依据MTT实验计算所得两株细胞的IC50,分别设置3个浓度梯度的莱菔硫烷处理组和1个对照组(加二甲基亚砜、Dimethyl sulfoxide、DMSO),其它实验条件相同,作用48小时后,收集细胞按凋亡检测试剂盒说明书进行操作,用流式细胞仪(fluorescence activated cell sorting, FACS)检测并分析不同浓度莱菔硫烷对两株细胞凋亡的影响。 3、不同浓度莱菔硫烷对鼻咽癌细胞肿瘤球的生长抑制情况：HONE1和CNE1所成肿瘤球(肿瘤球培养基培养5天所得),分别用3个浓度梯度的莱菔硫烷进行处理以及1个加DMSO作为对照。每隔2天收集肿瘤球并轻轻离心后,用加有DMSO或含不同浓度莱菔硫烷的新鲜肿瘤球培养基进行换液,继续培养生长至14天,显微镜下观察不同浓度下莱菔硫烷对两株细胞所成肿瘤球的生长抑制情况,测量各组最终所成肿瘤球的直径计算体积,并拍照。 4、不同浓度莱菔硫烷对HONE1、CNE1、NE2和Sunel细胞中肿瘤干细胞标志物β-catenin、Nanog、c-Myc、Oct3/4和Sox2蛋白的表达影响情况：四株细胞分别设置在3个浓度梯度的莱菔硫烷处理组和1个对照组(DMSO),其它处理和培养条件相同,作用48小时后,通过Western Blot实验分别检测四株细胞株各自在不同浓度的莱菔硫烷作用下,肿瘤干细胞相关标志物表达量的改变情况。 5、不同浓度莱菔硫烷在HONE1、CNE1、CNE2和Sunel细胞中对总STAT3、p-STAT3(Tyr705)和p-STAT3(Ser727)表达水平的影响：四株鼻咽癌细胞分别设置在3个浓度梯度的莱菔硫烷处理组和1个对照组(DMSO),其它处理和培养条件相同,作用48小时后,提取细胞总蛋白通过Western Blot实验检测两株细胞在不同浓度的莱菔硫烷作用下STAT3及其磷酸化水平的改变情况；HONE1和CNE1细胞爬片后用10μmol/L的莱菔硫烷(处理组)或DMSO(对照组)处理48小时,用免疫荧光实验检测两组的STAT3和两个p-STAT3改变情况,并在正置荧光显微镜下拍照。 6、细胞株HONE1和CNE1在5ng的EGF刺激下,不同浓度莱菔硫烷对这两株细胞中总STAT3、β-catenin和Nanog蛋白表达水平的影响。实验分为五个组：空白组(DMSO+Ong的EGF)、对照组(DMSO+5ng的EGF)、实验组(5μM的SF+5ng的EGF)、实验组(10μM的SF+5ng的EGF)和实验组(20μM的SF+5ng的EGF)处理48小时后,收集蛋白用Western Blot检测。 7、STAT3蛋白上游miRNAs的寻找和确定：首先通过3个不同的miRNAs数据库预测可能靶向STAT3蛋白的上游miRNAs,选定其中6个最为可能的miRNAs,进行下一步筛选。HONE1和CNE1细胞在3个不同浓度莱菔硫烷和1个加DMSO作为对照的处理作用48小时后,分别提取两株细胞的总RNA,进行特异性逆转后,通过荧光定量聚合酶链反应(Q-PCR),检测不同浓度的莱菔硫烷处理后所选6个miRNAs的表达改变情况,寻找莱菔硫烷作用后表达量改变最为明显的miRNA,再结合查阅到的相关研究,最终确定用于下一步实验miRNA。 8、莱菔硫烷上调miRNA-124-3p表达从而降低STAT3的实验：合成miRNA-124-3p的模拟物(mimic)和抑制剂(nhibitor)，，分别转染HONE1和CNE1细胞,在无血清的DMEM用lipo2000进行转染,培养8-12小时后,换成普通培养基并做相应的处理。实验分为5组：对照组、单加miRNA-124-3p mimic组、单加miRNA-124-3p inhibitor组、单加SF(10μmol/L)组和miRNA-124-3p inhibitor+SF(10μmol/L组。48小时后,收集蛋白,通过WesternBlot实验检测其各自STAT3蛋白的表达改变情况。研究结果 1、莱菔硫烷对鼻咽癌细胞株HONE1和CNE1的生长均有抑制作用,莱菔硫烷对HONE1和CNE1两株细胞的IC50值分别为9.51μmol/L和16.86μmol/L,结果显示HONE1细胞对莱菔硫烷更为敏感一些。 2、用AnnexinV-FITC/PI试剂盒检测不同浓度莱菔硫烷下HONE1和CNE1细胞的凋亡改变情况,FACS检测结果显示：莱菔硫烷对HONE1和CNE1细胞的凋亡均有影响,48小时处理后,两株细胞发生凋亡的比例均随着药物浓度的增加而增大。浓度为0、5、10、20μmol/L的莱菔硫烷分别作用于HONE1和CNE2细胞48小时后,细胞凋亡比例分别为0.9%、1.2%、2.2%、6.4%和0.9%、1.0%、1.3%、5.0%。结果表明,莱菔硫烷促进HONE1和CNE1凋亡的发生,并且在高浓度时更为明显。 3、莱菔硫烷抑制HONE1和CNE1所成肿瘤球的生长,肿瘤球最终生长体积随着药物浓度的增大而减小,并且对肿瘤球体积的影响在5μmol/L的浓度下就很明显。 4、Western Blot实验结果显示莱菔硫烷处理鼻咽癌细胞48小时后,HONE1、CNE1、CNE2和Sune1细胞中β-catenin、Nanog、c-Myc、Oct3/4和Sox2的蛋白表达量均下降,并且随着SF药物浓度的增大,表达量抑制程度增加。结果表明,SF能够抑制鼻咽癌细胞中肿瘤干细胞标志物分子的表达。 5、Western Blot实验结果显示莱菔硫烷处理鼻咽癌细胞48小时后,四株鼻咽癌细胞中总STAT3、p-STAT3(Tyr705)和p-STAT3(Ser727)的蛋白表达量均下降,并且随着SF药物浓度的增大,STAT3抑制程度增加；免疫荧光实验结果显示10μmol/L的莱菔硫烷处理HONE1和CNE1细胞48小时后,总STAT3、p-STAT3(Tyr705)和p-STAT3(Ser727)的蛋白表达量均下降。结果表明,莱菔硫烷在对鼻咽癌细胞的生长抑制中,至少部分是通过抑制STAT3蛋白的表达来实现的。 6、Western Blot实验结果显示：HONE1和CNE1细胞在EGF刺激作用下,莱菔硫烷依然能够降低β-catenin、Nanog和STAT3的表达水平,说明莱菔硫烷降低鼻咽癌细胞中β-catenin、Nanog和STAT3的表达不依赖于EGF,有可能是通过其它途径实现的。 7、莱菔硫烷下调HONE1和CNE1细胞中STAT3表达的同时,涉及miRNAs表达的改变,并且miRNA-124-3p的表达改变情况在两株细胞中最为明显。HONE1和CNE1的miRNA-124-3p的表达明显升高,在5、10、20μmol/L的SF浓度下,HONE1和CNE1细胞中miRNA-124-3p的表达量与对照组相比分别上升2、3.5、4倍和1.5、2.5、3.5倍。 8、Western Blot结果显示：miRNA-124-3p的mimic能够降低STAT3的表达量,和莱菔硫烷作用48小时后的效果类似；rmiRNA-124-3p的imhibitor单独处理组,STAT3有稍微升高；而miRNA-124-3p的inhibitor和莱菔硫烷共处理后STAT3降低效果被抑制。该实验结果表明,莱菔硫烷抑制鼻咽癌细胞HONE1和CNE1中STAT3表达是通过升高miRNA-124-3p来实现的。研究结论 1、莱菔硫烷抑制鼻咽癌细胞株HONE1和CNE1的生长增殖,促进鼻咽癌细胞发生凋亡,抑制HONE1和CNE1细胞肿瘤球的生长。 2、莱菔硫烷能够抑制鼻咽癌细胞中肿瘤干细胞标志物β-catenin、Nanog、 c-Myc、Oct3/4和Sox2的表达。 3、莱菔硫烷能够降低鼻咽癌细胞中总的STAT3、p-STAT3(Tyr-705)和p-STAT3(Ser727)的表达水平。 4、莱菔硫烷在EGF刺激下依然能够降低HONE1和CNE1细胞中β-catenin、 Nanog和STAT3的表达量。 5、莱菔硫烷降低HONE1和CNE1细胞中STAT3蛋白表达的过程中涉及miRNA-124-3p的升高,并且miRNA-124-3p的inhibitor能够对抗莱菔硫烷抑制STAT3表达的效果,表明莱菔硫烷在抑制鼻咽癌细胞生长、侵袭和转移中,至少部分是通过升高miRNA-124-3p靶向抑制STAT3来实现的。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.63

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