EphA2基因过表达对氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞损伤的保护作用

发布时间：2019-02-16 08:29

【摘要】：年龄相关性白内障(Age-Related Cataract, ARC)，又称老年性白内障，是50岁及以上人群中开始发生的进行性晶状体混浊。尽管先进的手术可以治疗白内障，但其目前仍是世界上引起低视力和盲的主要原因。晶状体上皮细胞（Lens Epithelial Cells, LECs）在晶状体内环境的维持和防御中发挥着重要的作用。当晶状体内活性氧及其它自由基产生过多，超过其自身抗氧化清除能力时，氧化应激可造成蛋白质结构改变和变性，DNA和线粒体损伤，最终引起晶状体上皮细胞凋亡。 Eph受体酪氨酸激酶A2（EphA2）是Eph亚族A类成员之一，位于1号染色体36区短臂，编码976个氨基酸残基的Ⅰ型膜蛋白，由胞外NH2末端区和胞内COOH末端区构成。近来发现，EphA2基因单核苷酸多态性与多种类型白内障发生密切相关，然而其在白内障发病中的具体机制仍尚不十分清楚。为了探究EphA2基因在氧化应激中的作用，，我们检测经不同浓度和时间过氧化氢处理的人晶状体上皮细胞中的EphA2基因表达水平；构建EphA2基因真核表达质粒转染到人的晶状体上皮细胞中，观察EphA2基因过表达对人晶状体上皮细胞及过氧化氢诱导人晶状体上皮细胞凋亡的影响；为了进一步探究EphA2基因表达水平与白内障发病的相关性，我们检测大鼠白内障晶状体、老龄和青年透明晶状体中的EphA2基因表达水平的差异。第一部分：氧化应激对人晶状体上皮细胞中的EphA2基因表达水平的影响目的：观察氧化应激对人晶状体上皮细胞（SRA01/04细胞）中的EphA2基因表达水平的影响。方法：用不同浓度（0μM、50μM、100μM、200μM和300μM）H2O2处理SRA01/04细胞，24小时后用CCK-8试剂盒检测细胞存活率。用H2O2（100μM和200μM）处理SRA01/04细胞24小时，建立急性氧化应激模型。用实时荧光定量PCR和Western blot检测急性氧化应激的SRA01/04细胞中的EphA2表达水平。用H2O2（50μM和100μM）处理SRA01/04细胞15天，建立慢性氧化应激模型。用实时荧光定量PCR和Western blot检测慢性氧化应激的SRA01/04细胞中的EphA2基因表达水平。结果：CCK-8结果显示，50μM H2O2对SRA01/04细胞存活率无明显影响（P=0.357）；而H2O2在100-300μM范围内呈剂量依赖性降低SRA01/04细胞存活率。100μM和200μM H2O2处理SRA01/04细胞24h后，细胞中EphA2mRNA和蛋白表达水平呈明显的升高。β-半乳糖苷酶染色结果显示：100μM处理组细胞染色阳性百分比显著高于50μM处理组（82±5.7%vs.19.2±7.3%，P=0.0000000004）。50μM H2O2处理SRA01/04细胞15天后，细胞中的EphA2mRNA和蛋白表达水平呈明显升高；而100μM H2O2处理细胞15天后，SRA01/04细胞中的EphA2mRNA和蛋白表达水平呈明显的下降。结论：在H2O2诱导的急性氧化应激损伤过程中，可促进SRA01/04细胞中的EphA2基因的表达；而在慢性氧化应激引起衰老的早期，可促进SRA01/04细胞中的EphA2基因表达；但随着衰老程度的加重，则抑制SRA01/04细胞中的EphA2基因的表达。第二部分：EphA2基因真核表达质粒的构建及转染人晶状体上皮细胞系的研究目的：验证构建的EphA2基因真核表达质粒是否能够在人晶状体上皮细胞中表达。方法：以pBABE-puro-EphA2质粒为模板，PCR扩增EphA2基因的cDNA；将EphA2cDNA克隆连接到真核表达载体（pIRES2-ZsGreen1）上；并行EcoRV和XhoI双酶切鉴定质粒及测序验证。利用Lipofectamine LTX将EphA2质粒转染到SRA01/04细胞中，于48h后荧光显微镜观察细胞的转染效率；实时荧光定量PCR和Western blot检测质粒转染48h后SRA01/04细胞中的EphA2mRNA及蛋白的表达水平。结果：EphA2基因真核表达质粒构建成功且测序验证正确。LipofectamineLTX介导质粒转染SRA01/04细胞的效率约为65%。EphA2质粒转染SRA01/04细胞48h后，EphA2mRNA和蛋白表达水平呈明显的升高。结论：EphA2基因真核表达质粒能够成功有效地在SRA01/04细胞中表达。第三部分：EphA2基因过表达对人晶状体上皮细胞增殖、细胞周期、凋亡和迁移的影响目的：观察EphA2基因过表达对人晶状体上皮细胞增殖、细胞周期、凋亡和迁移的影响。方法：SRA01/04细胞常规培养并分别转染空质粒和EphA2表达质粒。转染48小时后收集细胞；用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖情况；流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况；划痕实验检测细胞的迁移情况。结果：CCK-8实验结果显示，EphA2转染的SRA01/04细胞增殖比空质粒转染的SRA01/04细胞明显加快（P=0.0003）。流式细胞仪分析结果显示，EphA2转染的SRA01/04细胞比空质粒转染的SRA01/04细胞进入S期比例明显增多（P=0.008，t=㧟4.988）；而两种细胞凋亡比例无明显差异(P=0.486，t=0.776)。划痕实验结果显示，EphA2转染的细胞迁移速度比空质粒转染的细胞明显加快（P＜0.001）。结论：EphA2基因过表达能够促进SRA01/04细胞增殖和迁移、加快细胞周期的进程，而对细胞凋亡无明显影响。第四部分：EphA2基因过表达对氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的保护作用目的：观察EphA2基因过表达对氧化应激诱导的人晶状体上皮细胞凋亡的保护作用。方法：SRA01/04细胞常规培养并分别转染空质粒和EphA2表达质粒，48小时后获得过表达EphA2的SRA01/04细胞，然后分别用200μM H2O2处理24小时；CCK-8试剂盒检测细胞存活率；流式细胞仪检测凋亡细胞比例和ROS含量；Western blot检测BCL-2、BAX和Caspase-3蛋白表达水平。结果：EphA2基因过表达可提高SRA01/04细胞存活率，降低H2O2诱导的SRA01/04细胞凋亡比例和ROS含量，并可增加BCL-2蛋白表达，及抑制BAX蛋白表达，但对Caspase-3蛋白表达水平无明显影响。结论： EphA2基因过表达能够保护H2O2对SRA01/04细胞氧化应激损伤，其机制可能是通过增加BCL-2蛋白表达及抑制BAX蛋白表达。第五部分：EphA2基因表达水平与大鼠白内障发生的相关研究目的：观察EphA2基因在大鼠白内障晶状体中表达水平的变化情况。方法：选取36只SD大鼠的晶状体，分为3组，每组12只，分别是2月龄透明晶状体组（青年组）、16-18月龄透明晶状体组（老年组）和16-18月龄白内障晶状体组（白内障组）。采用实时荧光定量PCR和Western blot检测青年组、老年组和白内障组晶状体中的EphA2表达水平。结果：Western blot检测结果显示EphA2蛋白在白内障组中表达水平明显低于老年组（P=0.0000006，t=10.952）；而老年组比青年组EphA2蛋白表达水平呈明显的升高（P=0.001，t=㧟4.456）。实时荧光定量PCR结果显示，白内障组EphA2mRNA表达水平较老年组明显的升高（P=0.001，t=㧟4.518）；而老年组EphA2mRNA较青年组EphA2mRNA表达水平呈明显下降（P=0.000009，t=8.237）。结论： EphA2蛋白表达水平下降与大鼠白内障发生密切相关。随着大鼠月龄的增加，EphA2蛋白表达水平呈轻度升高。
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【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R776.1

【参考文献】