15-脂氧合酶-1基因转移抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管的作用及机制研究

发布时间：2019-03-27 20:24

【摘要】：第一部分15-脂氧合酶-1基因重组腺病毒的构建、包装、鉴定及表达 目的：构建携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)标签表达小鼠15-脂氧合酶-1(15-lipoxygenase-1,15-LOX-1)基因的重组腺病毒载体。 方法：从含有小鼠15-LOX-1基因的cDNA文库中,利用聚合酶链反应(PCR)获取并扩增15-LOX-1基因,将扩增后的产物定向克隆至真核表达载体pDC315-EGFP构建穿梭质粒pDC315-15-LOX-1-EGFP.将构建成功的携带EGFP标签的穿梭质粒pDC315-15-LOX-1-EGFP与腺病毒骨架质粒pBHGlox-ΔE1,3Ere共转染HEK293细胞,经位点特异重组得到重组腺病毒Ad-15-LOX-1-EGFP。通过观察HEK293细胞中EGFP的表达和免疫印迹法(Western blot)检测15-LOX-1蛋白的表达来鉴定重组腺病毒Ad-15-LOX-1-EGFP。经反复感染HEK293细胞扩增病毒后,利用Adeno-XTM腺病毒纯化试剂盒纯化病毒,终点稀释法测定病毒滴度。 结果：Western blot检测和EGFP表达观察证明已成功构建携带EGFP标签表达小鼠15-LOX-1基因的重组腺病毒Ad-15-LOX-1-EGFP;经过扩增纯化后,测得其病毒滴度为1.25×1011PFU/ml. 结论：应用细胞内同源重组的方法成功构建了携带EGFP标签表达小鼠15-LOX-1基因的重组腺病毒载体Ad-15-LOX-1-EGFP。 第二部分15-脂氧合酶-1在氧诱导视网膜病变小鼠模型的表达研究 目的：通过氧环境的变化诱导小鼠产生新生血管,建立氧诱导视网膜病变(oxygen induced retinopathy, OIR)模型。探讨15-酯氧合酶-1(15-LOX-1)在视网膜新生血管形成过程中的表达及其意义。 方法：将186只7日龄C57BL/6J小鼠随机分成正常对照组和诱导模型组。正常对照组置于正常环境温度下饲养；诱导模型组置于氧浓度为(75±2)%的密闭环境中饲养5天后转移至正常环境温度下再饲养5天,建立OIR模型。取两组17日龄小鼠眼球做石蜡包埋切片,行苏木精-伊红(HE)染色并计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目；取两组17日龄小鼠应用视网膜荧光血管造影观察视网膜血管的形态学变化和新生血管的形成。分别于7日龄、9日龄、12日龄、14日龄、17日龄和21日龄将上述两组小鼠处死,用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-Time PCR)和免疫印迹法(Western Blot)分别检测15-LOX-1在正常对照组视网膜和诱导模型组视网膜新生血管形成过程中的表达情况。 结果：视网膜荧光血管造影铺片结果显示在诱导模型组小鼠视网膜中有大量新生血管生成,其结构和分布紊乱；HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目诱导模型组与正常对照组相比,数量明显增加且差异具有显著性(P0.01)。Real-Time PCR和Western Blot结果显示在诱导模型组视网膜新生血管形成过程中15-LOX-1的mRNA和蛋白表达水平均明显降低,与正常对照组的差异均具有显著性(P0.05;p0.05),并且15-LOX-1的表达变化与视网膜新生血管的形成呈相反的趋势。 结论：研究结果表明在OIR小鼠模型中,15-LOX-1呈明显低表达,并且15-LOX-1的表达变化与视网膜新生血管的形成呈相反的趋势。15-LOX-1有可能是治疗视网膜新生血管性疾病的新靶点。 第三部分15-脂氧合酶-1基因转移抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管的作用及其机制研究 目的：探讨15-脂氧合酶-1(15-LOX-1)基因转移抑制氧诱导小鼠视网膜新生血管的作用及其机制。 方法：将108只7日龄C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、诱导模型组、基因治疗组和空白载体组。将小鼠与哺乳母鼠共同置于氧浓度为(75±2)%的氧箱内饲养5天后转移至正常氧环境中饲养5天建立氧诱导视网膜病变(oxygen induced retinopathy, OIR)模型。小鼠出生后12天基因治疗组玻璃体腔注射Ad-15-LOX-1-EGFP1.0μl;空白载体组注射等量Ad-EGFP。注射后第2天行视网膜铺片荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。注射后第5天行免疫荧光染色法检测15-LOX-1基因转染视网膜的表达；行实时荧光定量聚合酶链反应和免疫印迹法分别检测视网膜15-LOX-1、过氧化物酶增殖活化受体γ(PPAR-y)、血管内皮生长因子-A(VEGF-A)及血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)的mRNA和蛋白表达；行FITC-dextran荧光素造影视网膜铺片观察并测量视网膜无灌注区和新生血管的相对面积；行石蜡切片苏木精-伊红染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目。采用单因素方差分析及Bonferroni post检验进行各组间的数据比较。 结果：腺病毒Ad-15-LOX-1-EGFP注射2天后,在视网膜铺片上通过荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白的表达。免疫荧光染色结果显示15-LOX-1基因转染视网膜主要表达在外丛状层、内核层和神经节细胞层。基因治疗组15-LOX-1和PPAR-γ mRNA及蛋白表达水平明显高于诱导模型组和空白载体组(P0.01；P0.01);与之相反,基因治疗组VEGF-A和VEGFR-2mRNA及蛋白表达水平明显低于诱导模型组和空白载体组(P0.01；P0.01)。基因治疗组中视网膜无灌注区和新生血管面积均较诱导模型组和空白载体组显著减小(P0.01;P0.01);基因治疗组中突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目与诱导模型组和空白载体组比较亦明显减少(P0.01；P0.01)。 结论：15-LOX-1基因转移不仅可以减少氧诱导小鼠视网膜无灌注区面积,并且对视网膜新生血管有显著的抑制作用。15-LOX-1基因转移可能通过上调PPAR-γ,下调VEGF-A和VEGFR-2的表达发挥抑制视网膜新生血管的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R774.1

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本文编号：2448531