Orexin在大鼠视网膜中的表达及对神经节细胞上L型钙电流的调制

发布时间：2019-04-11 14:17

【摘要】：Orexin (又称为hypocretin)是一类神经活性肽,包括orexin-A(hypocretin-1)和orexin-B (hypocretin-2),它们分别含有33和28个氨基酸残基,由共同前体prepro-orexin经水解产生。Orexin通过与质膜上G蛋白偶联的特异性受体：orexin-1型受体(OXiR)和orexin-2型受体(OX2R)结合而发挥作用。在脑中,产生和分泌orexin的神经元特异地分布于下丘脑侧后部,并广泛投射至全脑。Orexin参与多种生理作用的调控,例如睡眠／觉醒、昼夜节律、神经元的放电、摄食行为等。然而,对这种调节肽在视网膜中的研究却基本上属于空白。唯一的工作显示,人的视网膜神经元表达orexin-A和orexin-B,但作者并未用免疫荧光双标检测这些神经元的细胞类型。本工作中,我们首先研究了orexin及其受体在大鼠视网膜各类细胞上的分布；并进一步研究了orexin-A对神经节细胞(ganglion cell, GC)上L型钙电流的调制作用及其机制。运用RT-PCR及免疫组化方法,我们的结果显示orexin及OX1R和OX2R的mRNA和蛋白均存在于大鼠视网膜中。Orexin-A和B的免疫荧光染色在内核层和神经节细胞层的许多细胞上可见。免疫双标实验显示,在外层视网膜,orexin-A和B表达在calbindin标记的水平细胞和homeobox protein Chx10标记的双极细胞上。在内层视网膜,orexin-A和B均表达在GABA能无长突细胞(amacrine cell, AC)上,包括酪氨酸羟化酶标记的多巴胺能AC和胆碱乙酰基转移酶标记的胆碱能AC上。甘氨酸能AC(包括AII型AC)也表达这两种肽。此外,orexin-A和B在所有cholera toxin B (CTB)逆行标记的GC上也有明显表达。OX1R表达在大部分GC和多巴胺能AC上,并在两个网状层上也有弥散的分布。与之形成对照的是,在大鼠视网膜中未检测到明显的OX2R的免疫荧光染色。这些结果提示,orexm可能参与调节内层视网膜神经元的功能。应用全细胞膜片钳记录技术,在大鼠视网膜薄片上,我们首先鉴定了L型钙电流。在细胞外液中,用5 mM Ba2+取代Ca2+,并施加TTX、TEA分别阻断电压门控钠通道和非选择性钾通道,将细胞钳制于-40 mV,去极化到0 mV,引出内向电流,此电流可被L型钙通道特异性激动剂BayK8644增大,并能被L型钙通道特异性阻断剂nifedipine阻断。接着,我们进一步研究了orexin-A对GC上L型钙电流的调制作用。结果显示,orexin-A能显著增大L型钙电流,并能被洗回。当胞外给予OX1R特异性阻断剂SB334867时可取消orexin-A对L型钙电流的增大作用,而OX2R特异性阻断剂TCS OX2 29则没有作用,表明orexin-A对L型钙电流的调制作用经由OX1R介导。L型钙通道的激活和稳态失活均不受orexin-A的影响。进而,我们详细研究了orexin-A增大L型钙电流的胞内机制。胞内施加G蛋白抑制剂GDP-β-S后,orexin-A不再增大L型钙电流,提示G蛋白参与上述作用。磷脂酰肌醇磷脂酶C (phosphatidylinositol phospholipase C, PI-PLC)抑制剂U73122可明显减弱orexin-A的作用,而磷脂酰胆碱磷脂酶C(phosphatidylcholine phospholipase C, PC-PLC)抑制剂D609却不起作用。此外,胞内施加10 mM BAPTA使细胞处于Ca2+-free条件下,再施加orexin-A,作用消失,说明orexin-A的作用有胞内钙的参与。当给予xestospongin-C (XeC)或肝素(heparin)阻断IP3受体介导的钙库释放,orexin-A的作用消失,而胞内给予ryanodine阻断ryanodine受体介导的钙库释放,orexin-A仍能增大L型钙电流。因此, orexin-A增大L型钙电流依赖于IP3受体介导的胞内钙库释放Ca2+。L型钙电流的增大也可被蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)抑制剂bisindolymeleimide Ⅳ (Bis Ⅳ)和Go6976所阻断。然而,蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)抑制剂KT5720或激动剂cAMP和蛋白激酶G(protein kinase G,PKG)抑制剂KT5823或激动剂cGMP均不影响orexin-A对GC上L型钙电流的增大作用。综上所述,本工作研究了orexin-A和B及其受体在大鼠视网膜上的分布,并进一步显示orexin-A与GC胞膜上的OX1R结合后,激活G蛋白/PI-PLC/IP3/Ca2+/PKC信号通路,进而增大GC的L型钙电流。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R774.1

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本文编号：2456478