【摘要】： [目的] 观察α-硫辛酸(ALA)对外源性H2O2诱导的人视网膜色素上皮ARPE-19细胞的氧化损伤是否具有保护作用,并通过细胞凋亡和细胞自噬角度研究α-硫辛酸对氧化应激下ARPE-19细胞的保护作用途径及其相关的分子机制。 [方法] 1.人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤模型建立及ALA保护作用观察。外源性过氧化氢(H2O2)梯度浓度作用于ARPE-19细胞,MTT法检测细胞生存力,2'7'-二氯荧光乙酰乙酸钠(DCFH-DA)荧光探针检验细胞内活性氧(ROS)的生成,确定H2O2的适合作用浓度。α-硫辛酸(ALA,37.5μM)作用于氧化应激下ARPE-19细胞,检测细胞生存率和细胞内ROS的改变。 2.氧化应激下RPE细胞凋亡及Akt-bcl-2/Bax-aspase-3途径的变化和ALA干预的影响。适合浓度(12.5mM)的H2O2作用于ARPE-19(氧化应激组),Hoechst33258染色定性细胞凋亡,Annexin V FITC-PI双染流式细胞术法定量检测氧化应激下的细胞凋亡,Western Blot法检测Akt磷酸化水平及凋亡相关因子Bcl-2、Bax蛋白表达,活性比色(DEVD法)检测Caspase-3活性。氧化应激下ARPE-19细胞以α-硫辛酸处理(ALA处理组,37.5μM)0、2、4、6、8、10小时后,Hoechst染色定性细胞凋亡,Annexin V FITC-PI双染流式细胞术法定量检测ALA干预后细胞凋亡变化,Western Blot法检测Akt磷酸化水平、凋亡相关因子Bax基因蛋白表达的变化,活性比色(DEVD法)检测Caspase-3活性的改变。 3.氧化应激下RPE细胞溶酶体稳定性及自噬相关蛋白Beclin 1、Atg-5、LC3的变化和ALA干预的影响。适合浓度(12.5mM)的H2O2作用于ARPE-19(氧化应激组),吖啶橙(AO)染色测定氧化应激下的细胞溶酶体膜稳定性,Real-time PCR检测自噬相关基因Beclin-1和Atg-5的mRNA表达水平,Western Blot法检测Atg-5及LC3Ⅰ、Ⅱ的蛋白表达。氧化应激下ARPE-19细胞以α-硫辛酸处理(ALA处理组,37.5μM)0、2、4、6、8、10小时后,AO染色测定ALA干预后细胞溶酶体膜稳定性变化,Real-time PCR检测自噬相关因子Beclin-1和Atg-5的mRNA表达水平变化,Western Blot法检测Atg-5及LC3Ⅰ、Ⅱ的蛋白表达变化。 [结果] 1.外源性H2O2作用下,ARPE-19的细胞生存力下降且呈剂量相关性,同时ARPE-19细胞内的活性氧(ROS)浓度上升,提示H2O2处理可诱导ARPE-19细胞的氧化应激损伤；H2O2的适合作用浓度为12.5mM。ALA处理后,ARPE-19细胞氧化应激下的生存率增加,同时细胞内的ROS浓度降低。 2.氧化应激组ARPE-19细胞凋亡明显增加,以早期凋亡为主(p0.05),晚期凋亡变化不显著；Akt的磷酸化水平增强,凋亡相关因子Bcl-2表达无明显变化而Bax表达上升,Caspase-3活性上升。ALA处理组ARPE-19细胞2、4、6、8、10小时细胞凋亡百分率均下降,具有统计学意义(p0.05)；Akt的磷酸化水平在4、6小时处显著增强,凋亡相关因子Bax蛋白在4、6、8小时处的表达降低,Bcl-2的表达及Caspase-3活性在各时间点无明显变化。 3.氧化应激组ARPE-19细胞酸性泡样细胞器(AVO)明显增加,溶酶体的破裂增多,自噬相关基因Atg-5的mRNA及蛋白水平表达增加,Beclin-1的mRNA和LC3Ⅱ的蛋白表达上调,LC3Ⅰ改变不明显。ALA处理组ARPE-19细胞AO染色检测结果显示细胞溶酶体破裂减少,自噬相关因子Atg-5的mRNA及蛋白表达水平在4、6小时下调,LC3Ⅱ的蛋白表达在作用4、6小时下调,而Beclin-1的mRNA和LC3Ⅰ的蛋白检测未显示明显差异。 [结论] 1.外源性H2O2可诱导人视网膜色素上皮ARPE-19氧化应激,导致细胞损伤。α-硫辛酸可降低细胞内氧化应激水平,减少ARPE-19的细胞损伤及死亡,发挥保护作用。 2.氧化应激下ARPE-19的细胞损伤可能与细胞凋亡增加有关。α-硫辛酸对氧化应激下ARPE-19细胞的保护作用可能通过减少细胞凋亡实现,这一作用可能与p-Akt的激活和Bax的表达下调相关。 3.氧化应激下ARPE-19的细胞损伤可能与细胞自噬增强有关。α-硫辛酸对氧化应激下ARPE-19细胞的保护作用可能通过减少自噬性细胞死亡实现,可能与Atg-5和LC3Ⅱ的表达下调相关。
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【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R774.1
【参考文献】
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