SOCS1沉默增强树突状细胞抗喉癌免疫效应

发布时间：2019-07-20 06:42

【摘要】：目的研究SOCS1沉默的树突状细胞特异性抗肿瘤作用机制,并探讨RNAi技术在喉癌基因治疗中的应用前景,为树突状细胞的临床应用提供新思路和理论依据。方法以细胞因子GM-CSF、IL-4和TNF-α体外诱导扩增外周血单核细胞来源的DC,倒置显微镜下观察DC形态特征;构建RNAi载体转染DC,Western blot检测SOCS1的表达情况,筛选抑制SOCS1表达的有效靶序列;流式细胞术检测DC表面分子CD83、CD86和HLA-DR的表达;ELISA法分析上清中IFN-γ的含量;MTT法评估DC刺激T细胞增殖的能力及诱导细胞毒性T细胞的杀伤活性。结果 DC体外诱导培养成功;设计的RNAi载体经测序验证无误。干扰序列5可显著下调SOCS1表达水平;SOCS1沉默联合喉癌Hep-2抗原致敏的DC可显著上调表面分子标志CD83(85.61±0.96)%、CD86(96.86±1.20)%和HLA-DR(98.02±0.94)%的表达;该组DC能有效刺激T细胞增殖,增加IFN-γ的分泌量,最终增强CTL的特异性杀伤作用,效靶比为50:1时其杀伤活性显著高于对照组(P0.01)。结论 SOCS1沉默并负载喉癌Hep-2抗原的DC可以产生高效而特异性的抗喉癌免疫应答。
【图文】：

细胞周围开始出现细小的树突状伪足；培养第 5 天细胞呈积聚趋势，形成大小不等的细胞集落，同时 DC 表面有许多微绒毛样突起 (图 1)；第 7天细胞表面出现大量伸展的须状毛刺呈典型的 DC形态。

2.2 RNAi 载体的鉴定 目的基因（SOCS1）RNAi 载体经 AgeⅠ和 EcoRⅠ双酶切后于 1％琼脂糖凝胶中电泳，PCR 鉴定阳性克隆(图 2)，阳性克隆 PCR 产物出现 366 bp 条带，空载体克隆 PCR 产物出现 307 bp条带，与预期相符。测得序列与原始序列进行比对结果吻合。2.3 SOCS1 沉默效率 在蛋白质相对分子质量 24 000的条带相对应的位置显色的条带判定为 SOCS1。RNAi 的各组 DC 在蛋白水平上 SOCS1 表达有显著性差异(图 3)。RNAi 组与阴性对照组(条带 2 和 3)相比，SOCS1 蛋白量减少，干扰序列 5 和干扰序列 6SOCS1表达显著降低(条带 8 和 9)，其中以 SOCS1-siRNA-5 干扰效果最明显(条带 8)。2.4 DC 表型分析 流式检测结果显示，，SOCS1-siR－NA 联合 Hep-2 抗原致敏的 DC 组(A 组)高表达成熟表面分子标志 CD83、CD86 和 HLA-DR
【作者单位】： 辽宁医学院第一附属医院耳鼻喉科;北京大学第三医院普外科;辽宁医学院附属第一医院眼科;
【基金】：辽宁省自然基金(20082180)
【分类号】：R739.65

【二级参考文献】

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本文编号：2516544