白介素-10修饰的树突状细胞在大鼠角膜移植中作用的研究

发布时间：2019-08-24 10:45

【摘要】：目的 1、探讨利用细胞因子诱生法,分离、提纯、培养大鼠骨髓源树突状细胞,研究白介素-10作用于树突状细胞后,树突状细胞表型及功能的变化。 2、建立大鼠穿透性角膜移植模型,研究未成熟树突状细胞在大鼠角膜移植排斥反应中的作用,寻找抑制角膜移植排斥反应的新方法。 3、通过RT-PCR方法和组织病理学检查,分别观察角膜移植术后第14天各组角膜IL-12、Th1/Th2细胞因子mRNA的表达情况和角膜的病理学改变,探讨未成熟树突状细胞诱导角膜移植免疫耐受的机制。 方法 1、用大鼠淋巴细胞分离液提取大鼠骨髓树突状细胞的前体细胞,以细胞因子诱生法进行细胞的原代培养,在树突状细胞培养至第6天,将实验分为3组:培养至6天的DC即6-DC组;继续培养至12天的DC即12-DC组;在第6天加入IL-10,继续培养至第12天即IL-10-DC组。通过流式细胞仪比较骨髓源树突状细胞成熟的特异性标志CD83和细胞表面共刺激分子CD86的表达;通过MTT法,比较树突状细胞刺激同种异体T淋巴细胞的增殖能力。 2、取供体Wistar大鼠骨髓进行细胞培养,将受体鼠随机分为3组:阳性对照组、6-DC组及IL-10-DC组,每组8只。分别于角膜移植术前3天尾静脉注射PBS、6-DC及IL-10-DC。术后每天对角膜植片进行临床观察,计算排斥反应指数并记录角膜植片存活时间。 3、实验分为4组,阴性对照组5只(10眼),为未经任何处理的SD大鼠;阳性对照组、6-DC组和IL-10-DC组各10只,分别于角膜移植术前3天受体鼠尾静脉注射PBS、6-DC及IL-10-DC。于术后14天,应用RT-PCR方法检测各组角膜IL-12、Th1细胞因子IL-2、IFN-γ和Th2细胞因子IL-4、IL-10 mRNA的表达,并行角膜组织病理学检查。 结果 1、树突状细胞前体细胞形态较规则,没有突起;培养至第2天,细胞体积增大,开始呈集落聚集,细胞表面出现面纱状或树枝状的突起;培养至第6天,细胞从集落分散,细胞体积更大,具有典型的树突状细胞的形态。流式细胞仪结果显示:IL-10-DC组CD83、CD86最低,12-DC组CD83、CD86最高,差异具有统计学意义(P0.01)。MTT结果显示:IL-10-DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力最弱,12-DC刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力最强,差异具有统计学意义(P0.01)。 2、阳性对照组、6-DC组、IL-10-DC组角膜植片的存活时间分别是10.63±2.00d、18.88±1.36d、24.50±2.07d,6-DC组、IL-10-DC组与阳性对照组比较差异具有统计学意义(P0.01);IL-10-DC组角膜植片存活时间与6-DC组比较显著延长(P0.01)。术后第14天阳性对照组、6-DC组、IL-10-DC组的排斥反应指数分别为6.44±1.43、2.38±0.92、2.00±0.71,6-DC组、IL-10-DC组与阳性对照组比较差异具有统计学意义(P0.01),IL-10-DC组较6-DC组有降低趋势,但无统计学意义(P0.05)。 3、RT-PCR结果显示,阴性对照组(正常大鼠)角膜IL-12及Th1细胞因子IL-2、IFN-γ见微量表达,Th2细胞因子IL-4、IL-10呈高表达。在阳性对照组中IL-12及Th1细胞因子IL-2、IFN-γmRNA显著高表达,而Th2细胞因子IL-4、IL-10呈低表达。与阳性对照组比较,各实验组IL-12和Th1细胞因子mRNA表达水平显著降低(P0.01),Th2细胞因子mRNA表达水平显著增高(P0.01);IL-10-DC组与6-DC组比较,差异有统计学意义。组织病理学检查,阳性对照组角膜植片明显增厚,基质层纤维结构紊乱,植片中有大量炎细胞浸润,可见到新生血管。6-DC组、IL-10-DC组炎症反应轻,无新生血管长入。 结论 1、通过细胞因子诱生法,成功培养了大鼠骨髓源树突状细胞。IL-10能降低大鼠骨髓源树突状细胞成熟特异性标志CD83和共刺激分子CD86的表达,抑制树突状细胞的成熟。 2、未成熟树突状细胞能延长角膜植片存活时间,诱导免疫耐受。IL-10-DC诱导免疫耐受的效果更好。 3、Th1细胞因子和IL-12在角膜移植排斥反应中发挥重要作用,而Th2细胞因子在抑制角膜移植排斥反应中起重要作用。诱导Th1/Th2偏离,抑制角膜炎症反应是未成熟树突状细胞诱导角膜移植免疫耐受的机制之一。
【图文】：

图 1 大鼠胫、腓骨 图 2 冲洗后大鼠胫骨图 3 淋巴细胞液分层 图 4 第 4 天细胞（×200）最上面一层红色为血浆，箭头标注的絮 细胞呈集落生长，集落较大，，细胞表面状层为单个核细胞，第 3 层透明层为淋 可见毛刺状突起巴细胞分离液，管底为红细胞

图 1 大鼠胫、腓骨 图 2 冲洗后大鼠胫骨图 3 淋巴细胞液分层 图 4 第 4 天细胞（×200）最上面一层红色为血浆，箭头标注的絮 细胞呈集落生长，集落较大，细胞表面状层为单个核细胞，第 3 层透明层为淋 可见毛刺状突起巴细胞分离液，管底为红细胞
【学位授予单位】：辽宁医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R779.65

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本文编号：2528908