EGFR，p-EGFR和E-cadherin在鼻咽癌中的表达及其与肿瘤侵袭转移的关系

发布时间：2019-09-03 08:28

【摘要】：鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma, NPC)是我国头颈部高发肿瘤之一,尤其广东、广西、湖南、福建和江西等五省是高发区。鼻咽癌大部分为低分化鳞癌,放射治疗为其首选治疗。但其低分化高转移的特点,使一部分病人在首诊时就出现了颈淋巴结和远处转移,而远处转移是鼻咽癌患者放疗后死亡的主要原因。鼻咽癌的侵袭转移是一个多环节、多步骤的复杂过程,包括肿瘤细胞粘附力下降、移动、酶降解和血管生成等多种肿瘤细胞的生物学行为,转移的确切机制目前尚不十分明确。上皮-间充质转型(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞向间质细胞转分化的现象,是多细胞生物形态学发生中的一个基本生理过程,表现为上皮细胞极性丧失,迁移能力增强,同时逐渐获得间质表型。EMT参与了上皮源性肿瘤的发生发展,尤其在肿瘤的侵袭转移方面。因此,对EMT在肿瘤侵袭转移中的作用及其调控机制的研究正越来越受到人们的关注。表皮生长因子受体(EGFR)是一种受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, PTK),属于Ⅰ型受体酪氨酸激酶超家族。可在多种上皮,间叶,神经起源组织中表达,是涉及细胞增殖和肿瘤发生、发展中的极为重要的受体信号系统,和肿瘤的侵袭、转移、恶性程度及预后密切相关。自身磷酸化是EGFR的活性主要调节方式,EGFR通过磷酸化的酪氨酸残基与下游底物酶反应而传递信号。其下游主要的信号通路包括Ras-Raf-MEK-erk/MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路和JAK/STAT信号通路等。PI3K-Akt信号通路活化是EMT发生的一个核心特征。 E-cadherin是一类介导同源细胞间互相粘附的钙依赖性跨膜糖蛋白,广泛分布于各类上皮细胞表面,在细胞形态发生、信号传导、细胞极性和组织结构完整性的维持中起重要作用,E-cadherin表达的缺失可导致细胞形态异常,极性消失,细胞间黏附能力降低,生长失控并向邻近组织侵袭,E-cadherin的表达下调或者缺失是EMT过程中的关键事件。目前,同时对EMT, EGFR信号通路和E-cadherin在鼻咽癌侵袭转移中的调控机制及相互关系的相关研究还未见有报道。本研究旨在探讨EGFR信号通路是否可以通过下调E-cadherin的表达调控鼻咽癌的EMT及转移侵袭能力,并分析EGFR,活化的EGFR (p-EGFR)和E-cadherin在鼻咽癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。目的 1.检测EGFR,活化的EGFR (p-EGFR)和E-cadherin蛋白在鼻咽癌组织中的表达水平,探讨其与鼻咽癌发生发展以及临床病理特征的关系,为临床上寻找鼻咽癌淋巴结转移和远处转移的肿瘤标志物提供研究基础； 2.检测EGFR, p-EGFR和E-cadherin蛋白在鼻咽癌细胞系中的表达,探讨其与鼻咽癌细胞侵袭转移能力的相关性； 3.探讨EGFR信号通路是否可以通过调节E-cadherin的表达调控鼻咽癌的EMT及转移侵袭能力。方法 1.检测EGFR, p-EGFR和E-cadherin蛋白在鼻咽癌组织中的表达。取54例鼻咽癌组织标木作为实验组,23例鼻咽粘膜慢性炎组织做对照组。 (1)免疫组化法研究EGFR, p-EGFR和E-cadherin蛋白在54例鼻咽癌组织中和23例鼻咽粘膜慢性炎组织中的表达水平； (2)探讨EGFR, p-EGFR和E-cadherin之间的关系及其与鼻咽癌临床病理特征的关系。 2.探讨鼻咽癌细胞系中EGFR, p-EGFR和E-cadherin蛋白表达水平与其迁移能力和侵袭转移能力的关系,及其三种蛋白表达水平之间的关系,为后续试验筛选出干预的细胞系。采用鼻咽癌细胞系5-8F, CNE-1, CNE-2,6-10B,用以下方法检测细胞迁移能力,侵袭转移能力,EGFR, p-EGFR和E-cadherin蛋白的表达情况。 (1)划痕愈合实验：检测鼻咽癌细胞系的运动迁移能力； (2) Transwell:检测鼻咽癌细胞系的侵袭转移能力； (3) Western blot:检测鼻咽癌细胞系中EGFR, p-EGFR和E-cadherin蛋白表达水平； (4)分析鼻咽癌细胞系中EGFR, p-EGFR和E-cadherin蛋白表达水平与其运动迁移能力和侵袭转移能力的相关性,及其三种蛋白表达水平之间的相关性。 3.探讨EGFR信号通路对E-cadherin表达的调节和对鼻咽癌细胞EMT的影响,以及细胞内EGFR的表达水平与其对小分子酪氨酸激酶抑制剂Erlotinib敏感性的关系。采用通过第二部分实验筛选出的高表达和低表达EGFR的鼻咽癌细胞系作为研究对象。 (1)MTT法：检测EGF(表皮生长因子)和Erlotinib对两种细胞的生长增殖(抑制)率,为下一步实验筛选出干预浓度； (2)倒置显微镜：观察干预前后细胞的形态变化； (3)划痕愈合实验：观察干预前后细胞的运动迁移能力变化； (4) Transwell:检测干预前后细胞的侵袭转移能力的变化； (5) Western blot:检测干预前后细胞内EGFR, p-EGFR, Vimentin和E-cadherin蛋白表达的变化； (6) RT-PCR:检测干预前后细胞内EGFR和E-cadherin mRNA表达的变化。结果 1.54例鼻咽癌组织中,37例表达EGFR(68.5%),33例表达p-EGFR(61.1%),19例表达E-cadherin(35.2%)；23例鼻咽粘膜慢性炎组织中8例表达EGFR(34.8%),5例表达p-EGFR(21.7%),21例表达E-cadherin(91.3%),经统计学分析EGFR, p-EGFR和E-cadherin在两种组织之间的表达差异有显著的统计学意义(p0.05)； 2. EGFR在鼻咽癌组织的表达水平与有无淋巴结转移有关(p0.05),与患者年龄,性别,原发灶大小,临床分期和远处转移均无相关性(p0.05)；p-EGFR在鼻咽癌组织的表达水平与患者年龄,性别,原发灶大小,临床分期,淋巴结转移和远处转移均无相关性(p0.05)；E-cadherin在鼻咽癌组织的表达水平与临床分期,有无淋巴结转移和远处转移有关(p0.05),与患者年龄,性别,原发灶大小无关(p0.05)； 3. EGFR和p-EGFR蛋白在鼻咽癌组织中的表达正相关(r=0.532,p0.05),和E-cadherin的表达负相关(r=-0.345,p0.05)；p-EGFR和E-cadherin的表达无相关性(r=-0.122,p=0.380)； 4.在鼻咽癌细胞系中,5-8F的侵袭转移能力最强,6-10B的侵袭转移能力最弱(p0.05)；EGFR和p-EGFR在5-8F中表达水平最高,在6-10B中表达水平最低(p0.05); E-cadherin在5-8F中的表达水平最低,在6-10B中的表达水平最高(p0.05)； 5.在鼻咽癌细胞系中,EGFR和p-EGFR的表达水平与细胞的侵袭转移能力正相关,E-cadherin的表达水平与细胞的侵袭转移能力负相关； 6.EGF干预鼻咽癌细胞5-8F后,细胞形态向间质表型转化,迁移和侵袭转移能力增强,p-EGFR和Vimentin蛋白表达增高蛋(p0.05), E-cadherin蛋白及mRNA的表达均下调(p0.05),EGFR蛋白及mRNA表达无显著变化(p0.05)； 7. Erlotinib干预鼻咽癌细胞5-8F后,细胞形态向上皮表型转化,生长受抑制,迁移和侵袭转移能力下降,p-EGFR和Vimentin蛋白的表达下降(p0.05),E-cadherin蛋白和mRNA的表达均上调(p0.05), EGFR蛋白及：mRNA表达无显著变化(p0.05)； 8.EGF和Erlotinib干预鼻咽癌细胞6-10B后,细胞形态变化不明显；迁移和侵袭转移能力无显著改变(p0.05),p-EGFR和Vimentin蛋白表达差异无显著统计学意义(p0.05),E-cadherin蛋白及(?)nRNA的表达差异无显著统计学意义(p0.05),EGFR蛋白及mRNA的表达差异无显著统计学意义(p0.05)。结论 1. EGFR信号通路与E-cadherin在鼻咽癌的发生发展中分别发挥了不同的作用； 2. EGFR和E-cadherin的异常表达可能影响了NPC患者N和M分期； 3. EGFR信号通路可能通过调控E-cadherin的表达影响鼻咽癌细胞的EMT和侵袭转移能力； 4.鼻咽癌细胞系对EGFR抑制剂的敏感性依赖于胞内EGFR的表达水平； 5. EGFR抑制剂可通过上调E-cadherin的表达影响鼻咽癌细胞EMT进程,从而抑制鼻咽癌细胞侵袭转移能力。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R739.6

【参考文献】