CCR3拮抗剂在实验性角膜新生血管发生过程中的作用和机制

发布时间：2019-09-24 18:10

【摘要】：背景与目的正常角膜的透明性是维持良好视力的重要因素之一。当炎症、外伤、缺氧等因素破坏了促血管生成因子和抑制血管生成因子之间的平衡，促使血管从角膜缘长入角膜，是导致视力减退甚至盲目的一个主要原因。目前关于角膜新生血管(CRNV)的发病机制尚未完全阐明，生长因子、细胞因子、趋化因子等炎症介质发挥的作用一直是研究关注的重点。 CC趋化因子受体3（CCR3）是一个G蛋白偶联受体，主要表达在嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、Th2淋巴细胞、肥大细胞及巨噬细胞，其中嗜酸性粒细胞高表达。既往研究CCR3的主要功能是募集白细胞（主要是嗜酸性粒细胞和Th2细胞）至炎症部位，参与过敏性疾病（如哮喘）的发病机制。此外，CCR3也表达于血管内皮细胞，并参与血管生成。而且CCR3信号在脉络膜新生血管的发展中发挥了关键作用。并参与角膜缝线法诱导小鼠角膜新生血管的生长，但CCR3信号在角膜新生血管中的表达及具体作用机制仍不明确。碱烧伤诱导的CRNV是一种被普遍认可的角膜新生血管的动物模型。为了明确CCR3信号在角膜新生血管中的表达及作用机制，本课题从建立小鼠碱烧伤CRNV模型着手，应用Real-time PCR方法检测CCR3、Eotaxin mRNA在受损角膜组织中各个时间点上的表达。应用角膜铺片荧光染色法和流式细胞术观察局部应用CCR3小分子拮抗剂SB328437进行早期干预后，对碱烧伤诱导的CRNV形成的影响。采用Real-timePCR和Western blot法从基因水平及蛋白水平检测并比较SB328437早期干预后角膜组织内VEGF表达的变化，明确CCR3信号的作用机制。并应用培养的人视网膜血管内皮细胞株（HREC），通过细胞增殖实验和管腔形成实验，进一步证实CCR3信号在血管发生、发展中的作用，为临床治疗新生血管性眼病提供了一定的理论依据。研究方法 1. BALB/c小鼠60只，以碱烧伤诱导CRNV模型，收集碱烧伤后0d、2d、4d、7d各时间点的角膜组织，以Real-time PCR检测碱烧伤诱导小鼠CRNV过程中角膜组织内各时间点CCR3、Eotaxin mRNA的表达。 2. BALB/c小鼠60只，随机分为实验组和对照组。碱烧伤后立即予局部点眼干预：实验组使用1μmol/ml CCR3拮抗剂，对照组使用0.2%透明质酸钠，每天3次，每次3μl，共干预1周。在角膜组织碱烧伤2周后，大体拍照初步观察两组角膜新生血管形成情况后处死小鼠并摘除实验眼球，应用角膜铺片CD31荧光染色法检测新生血管区域占整个角膜的面积比例，应用流式细胞术检测角膜组织中CD31阳性细胞数目，观察CCR3拮抗剂对碱烧伤CRNV形成的影响。 3. BALB/c小鼠60只，随机分为实验组和对照组：干预方法同前，碱烧伤后4d，收集各组角膜组织，，应用Real-time PCR及Western blot法从基因水平和蛋白水平检测各组角膜组织中VEGF的表达。观测CCR3信号通路与角膜组织内VEGF表达的相关性。 4. HREC细胞铺于96孔培养板中。随机分为五组，分别以0.1μmol/ml，0.2μmol/ml，0.5μmol/ml，1μmol/ml的CCR3-antagonist干预，等量的PBS缓冲液作为对照。干预24h后加入CCK8细胞增殖检测液，分光光度仪450nm波长下检测各孔OD值。通过OD值计算和分析CCR3-antagonist对HREC细胞株增殖的影响。 5. HREC细胞铺于含Matrigel的96孔培养板中，随机分为1μmol/ml CCR3-antagonist干预组和PBS缓冲液对照组。在37℃，50ml/L CO2培养箱中培养24h后，观察管腔形成情况。测定CCR3拮抗剂对HREC血管网形成的影响。结果 1.碱烧伤后CCR3、Eotaxin mRNA的表达有升高趋势，提示CCR3-Eotaxin信号参与碱烧伤诱导的角膜新生血管的发生发展过程。 2.局部应用CCR3-antagonist能抑制碱烧伤诱导的CRNV。 3. CCR3-antagonist能抑制HREC的增殖，并在一定浓度范围内呈剂量依赖性。而且CCR3-antagonist能够抑制HREC血管网的形成。结论 CCR3信号通路参与角膜新生血管的发生过程，阻断其信号通路则抑制血管内皮细胞的增殖和抑制血管网的形成，从而抑制新生血管的发生、发展，为临床进一步通过干预CCR3信号通路治疗新生血管性眼病提供有力的理论依据。
【图文】：

烧伤后不同时间点角膜组织内CCR3与EotaxinmRNA的表达

CCR3拮抗剂在实验性角膜新生血管发生过程中的作用和机制

CCR3拮抗剂干预对碱烧伤诱导角膜新生血管形成的影响
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R772.2

【参考文献】