血管抑素溶液在大鼠角膜新生血管中的作用研究

发布时间：2017-03-18 08:07

  本文关键词：血管抑素溶液在大鼠角膜新生血管中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景： 病理性新生血管是多种眼部疾病中的一种表现,如：角膜新生血管、新生血管性青光眼、老年性黄斑变性、视网膜新生血管、糖尿病视网膜病变。在欧美等国家,因眼部新生血管已成为导致失明的首要因素。我国作为发展中国家,眼部损伤啊成为一种常见病、多发病,均可引起的角膜新生血管,约占角膜疾病的10%,其中角膜碱烧伤在角膜化学性损伤中后果尤为严重,因碱性溶液可不断侵蚀角膜各层组织,所以它所致的失明是当前最突出、最棘手的问题。与角膜新生血管密切相关疾病有：感染、眼外伤、角膜化学伤、免疫源性眼病等；其中又以化学伤中的碱烧伤后引起的角膜新生血管影响视力最明显。 正常角膜光滑透明无血管,尽管角膜新生血管的生长有利于清除局部感染、促进伤口愈合、抑制角膜溶解、促进组织修复等,但是由于其结构和功能的不完善,易产生血浆渗漏、角膜水肿、炎性细胞浸润,这些均会导致角膜丧失“免疫豁免”权限,引起视力下降、甚至视力丧失,影响角膜透明度及后续治疗中的角膜移植。 随着科学技术的发展,对角膜新生血管的研究深入,大量实验研究发现角膜新生血管的形成是多因素参与的结果。1血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor VEGF)血管内皮生长因子是1989年由Ferrara发现,是内皮细胞特异性促有丝分裂原,通过特异性受体介导作用于血管内皮细胞,对血管内皮细胞发挥促分化和趋化作用,并促进内皮细胞增殖和迁移。同时增加血管通透性,以利于新生血管和基质细胞生长。血管内皮生长因子在促进血管新生、维持血管形态及完整性具有重要意义。2成纤维细胞生长因子(FGF)成纤维细胞生长因子是Gospodarowicz于1974年发现的一种促纤维母细胞生长因子,并广泛存在于多种组织中。其生物学活性通过受体介导实现；其中碱性FGF生物性最强,主要促进新生血管形成、促进血管平滑肌细胞、促进内皮细胞增殖、参与组织修复和炎症反应等。3白细胞介素(IL)白细胞介素主要是由单核细胞产生的一组细胞因子,作用于巨噬细胞、淋巴细胞,也必须通过特异性受体介导才可发挥其生物活性,对细胞的激活、分化和增殖的作用。正常情况下IL与其他细胞因子共同维持角膜的微环境；但是有实验发现在损伤后角膜的中IL-8表达量明显增高,可初步证明其对组织新生血管的影响为促进作用。4转化生长因子-β(TGF-β)转化生长因子-β是由DeLarco在1978年发现,其生物活性是通过受体信号传导途径实现,其对细胞增殖、分化和凋亡发挥调控作用；在正常角膜中转化生长因了-β是处于一种低水平表达状态以维持正常的角膜形态和角膜局部免疫功能；但是在实验研究过程发现在角膜化学伤后产生的角膜新生血管的角膜组织中存在高表达,同时与新生血管的量成一定关系：随着新生血管的数量增多,其表达含量也同时升高；即可认为在角膜新生血管的形成过程中存在一定促进作用。5基质金属蛋白酶(MMPs)基质金属蛋白酶是一组Zn2+依赖的降解细胞外基质成分的内源性蛋白水解酶,主要由成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞等合成与分泌。其生物学功能主要有降解细胞外基质膜有效成分、调节粘附、直接或间接参与胚胎发育等。正常组织中其处于抑制状态。有研究表明当角膜产生新生血管时,其处于强表达,并在新生血管膜的周边血管外的基质中显著增多。 近年来根据对角膜新生血管生长机制研究、动物实验、细胞培养和临床实验研究,并针对发病机制和原理,出现多种治疗方法及治疗药物；各种药物及治疗方法都能在一定程度上对角膜新生血管起治疗作用,不仅可以抑制角膜新生血管的增殖,同时可引起已形成的新生血管出现萎缩、凋亡等。这为治疗角膜新生血管提供强有力的动力。1抗VEFG药物包括VEFG单克隆抗体、VEGFR酪氨酸激酶抑制剂、抗VEGF抗体等；其中使用较广的有贝伐单抗Bevacizumab,其对VEGF A的所有亚型都具有亲和力,其抗新生血管的主要机制是通过阻止VEGF与内皮细胞表面的VEGFR1和VEGFR2受体结合,阻止血管渗漏和新生血管的形成,从而使内源化VEGF的生物活性失效。VEGFR的酪氨酸激酶域是VEGF信号转导的起点,受体介导而被激活,阻断该位点可以有效的抑制VEGF介导的血管生成作用。2CNV抑制因子众多研究显示,促血管生长因子的增加打破了控制角膜血管形成的网络平衡,使新生血管得以形成,而增加血管生长抑制因子,可加强抗血管形成的力量,使血管控制网络重新恢复平衡,新生血管消退。其中以血管内皮抑素最为重要；内皮抑素是由O'Relly发现的一种内源性血管内皮细胞增殖的强效抑制剂；内皮抑素特异性地作用于内皮细胞,尤其是微血管的内皮细胞,抑制其迁移,诱导其凋亡,从而抑制血管的生成。3糖皮质激素糖皮质激素具有显著的抗炎和免疫抑制作用,可以减少炎性渗出,抑制成纤维细胞增生和新生血管的生成。有研究发现其对新生血管的抑制作用主要通过抑制内皮细胞的移行及血管形成。4血管抑素(Angiostatin AS)K1-4血管抑素K1-4是纤溶酶原的降解片段并具有强大的抑制新生血管形成作用,可特异地抑制处于增殖状态的血管内皮细胞并诱导内皮细胞的凋亡,来发挥强大的抑制新生血管的作用,并且不影响静止的内皮细胞。虽然对于角膜新生血管的治疗方法多样,但仍然未有一种疗效较为确切、实用的治疗方法。 本课题主要目的是通过配制不同浓度的血管抑素眼用溶液,以研究血管抑素对碱烧伤后角膜新生血管的抑制作用及最佳浓度。 目的： 1、探讨不同浓度的血管抑素对体外培养的人脐静脉内皮细胞的抑制作用； 2、探讨血管抑素眼用溶液在大鼠角膜碱烧伤后的角膜新生血管中影响CD31的表达情况及比较各组角膜新生血管的生长情况。 方法： 1、在体外培养的情况下,将传代培养后的人脐静脉内皮细胞分为三组：对照培养组(空白组)、A组(16ml/L血管抑素培养组)、B组(32ml/L血管抑素培养组),通过MTT法观察用药后24h、48h、72h三组细胞的抑制率；将培养72h后的细胞粉碎,分别采用VEGF和GAPDH引物,以cDNA为模板按照下面的反应体系进行PCR特异性扩增,通过荧光定量PCR法测定各组VEGF蛋白的RNA表达情况；收集A组、B组、C组三组细胞以western blot法检测VEGF蛋白表达量。 2、通过碱烧伤制备动物角膜新生血管模型；SPF级SD大鼠24只,随机分成4组,每组6只。分别给予生理盐水、A组(25ug/mL AS滴眼剂)、B组(50ug/mLAS滴眼剂)、C组(75ug/mL AS滴眼剂),4次/d至实验结束。术后常规滴用氧氟沙星滴眼液4次/d,1滴/次,用药3d,预防感染。通过计算角膜新生血管的生长情况、HE染色、RT-PCR、Western bolt检测碱烧伤后不同浓度的角膜组织中CD31的表达情况。 结果： 1、血管抑素对体外培养的人脐静脉内皮细胞的抑制实验表明：随着血管抑素作用时间的延长和浓度的递增对人脐静脉内皮细胞的抑制作用也逐渐增强,且与对照组相比差异均有显著性意义(P0.01)； 2、大鼠角膜碱烧伤后各时间点A、B、C组CNV面积较盐水组少(P0.05),C组碱烧伤14天各时间新生血管面积较其他三组明显减少(P0.05)；血管抑素治疗两周后,对照组大鼠角膜全层可见大量新生血管形成及慢性炎细胞浸润；各治疗组角膜新生血管均不同程度较对照组减少； 3、各实验组角膜组织中CD31-mRNA及CD31表达均少于对照组(P0.05),同时在实验组中与血管抑素的浓度呈负相关性。 结论： 1、通过体外细胞培养技术,证明血管抑素对人脐静脉内皮细胞的抑制作用与血管抑素浓度和作用时间成双重负相关性。 2、血管抑素作用VEGF靶点后抑制血管新生,从而抑制内皮细胞的迁移、生成、重组,减少内皮细胞的生长；本实验中通过检测各组角膜组织中CD31这一血小板内皮细胞粘附分子的表达量,证明新生血管的生长在血管抑素制剂治疗下的情况。试验中可以明显观察到各组角膜新生血管的生长情况,可得知对新生血管的抑制效果与血管抑素的浓度呈相关性变化,及浓度越高,新生血管越少。 3、血管抑素是机体正常情况下生成的细胞因子,同时由于血管抑素的高效性选择性等优点,在治疗角膜新生血管疾病方面,具有很大的潜能；为血管抑素制剂的临床开发奠定了基础。
【关键词】：角膜 新生血管 血管抑素 CD31 VEGF
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R772.2
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-14
• 前言14-19
• 参考文献18-19
• 第一章 血管抑素溶液对血管内皮细胞的作用研究19-34
• 1. 材料与方法19-28
• 2. 结果28-30
• 3. 讨论30-31
• 参考文献31-34
• 第二章 血管抑素溶液在大鼠角膜新生血管中的作用研究34-49
• 引言34
• 1. 材料和方法34-40
• 2. 结果40-44
• 3. 讨论44-46
• 参考文献46-49
• 全文小结49-50
• 致谢50-52
• 攻读硕士期间发表论文52-54
• 统计学证明54

【参考文献】

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1 艾鹏,谭最;促血管生成素在机体血管形成过程中的作用[J];国外医学(外科学分册);2005年01期

  本文关键词：血管抑素溶液在大鼠角膜新生血管中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：254159