胚胎干细胞大鼠内耳导入后的迁移与分化

发布时间：2019-10-03 05:42

【摘要】：胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)可在体外无限增殖,且保持未分化状态,其在特定环境下可被诱导分化为各种组织细胞,因此成为人体器官功能丧失后替代治疗的理想选择。目前,对内耳毛细胞损伤导致的永久性感音神经性耳聋尚无有效的治疗方法,为此,国内外众多学者开始探索将ESCs诱导分化为内耳细胞并进一步治疗耳聋的可行性。本研究旨在初步观察未经体外诱导分化的ESCs导入听力正常及氨基糖甙类药物致聋大鼠鼓阶后,ESCs在内耳的存活、分布及分化情况。第一部分氨基糖甙类药物性耳聋大鼠模型的建立目的:观察阿米卡星对新生大鼠耳蜗的损伤作用,探讨耳蜗毛细胞完全缺失大鼠模型的建立方法。方法:9天龄wistar乳鼠30只,随机分成听力正常对照组(10只)和阿米卡星致聋组(20只)。后者每日一次皮下注射硫酸阿米卡星(500mg/kg),连续7天。分别于给药结束后1周、6周和12周进行短纯音听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)测试、耳蜗冰冻切片和扫描电镜形态学观察。结果:阿米卡星组20只大鼠全部存活,给药6周后双耳各频率ABR阈值大于95 dBSPL,继续观察至12周听力无恢复。扫描电镜和HE染色观察显示给药6周后耳蜗各回内、外毛细胞全部丧失。结论:中等剂量阿米卡星连续给药可致新生大鼠耳蜗毛细胞全部丧失,以及永久性极重度感音神经性耳聋,是进行干细胞内耳植入治疗的理想模型。第二部分胚胎干细胞内耳植入方法研究目的:探讨外源胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)内耳导入的有效方法。方法:5-6周龄Wistar大鼠10只,右耳为实验耳,经鼓阶打孔法植入带有绿色荧光蛋白(EGFP)的ESCs;左耳为对照组,不实施手术。术前1周与术后即刻行ABR检查,术后36小时取双侧耳蜗做冰冻切片,观察ESCs在内耳的存活和分布情况。结果:导入的ESCs大部分聚集悬浮于鼓阶外淋巴中,少数在鼓阶基底膜嵴及外侧壁贴壁生长,柯替器等中阶部位未见有ESCs的分布。ABR检测显示鼓阶打孔途径导入ESCs可使大鼠听力下降约10 dB。结论:经鼓阶打孔途径导入耳蜗的ESCs可存活,该操作对内耳损伤小,可作为内耳细胞移植的有效方式。第三部分胚胎干细胞导入药物致聋大鼠内耳后的迁移与分化目的:探讨ESCs在药物致聋大鼠内耳的存活、分布及分化情况。方法:18只新生Wistar乳鼠随机分成2组:正常对照组(不给予药物致聋)8只和药物致聋组10只,左耳阴性对照,右耳通过鼓阶底转打孔途径导入干细胞。分别于导入ESCs后2周和6周进行内耳组织冰冻切片荧光观察。结果:导入2周后,对照组ESCs全部聚集于鼓阶内,药物致聋组可见少数外源细胞从鼓阶迁移至中阶;导入6周后,对照组鼓阶、中阶均未见存活的ESCs,药物致聋组在鼓阶内壁、骨螺旋板、螺旋韧带、内沟细胞、外沟细胞和柯替氏器部位可见ESCs分布,其中部分在柯替氏器部位表达毛细胞标记物myosinⅦa。结论:内耳损伤的微环境下,导入内耳的ESCs存活期延长,部分由鼓阶向中阶迁移,少数可分化为毛细胞前体细胞。
【图文】：

耳蜗损伤,阿米卡星,HE染色,支持细胞

图 2：阿米卡星对幼年大鼠耳蜗损伤作用的形态学观察A. 正常大鼠耳蜗柯替氏器，内、外毛细胞完好；B. 给结构，内、外毛细胞缺失，支持细胞、神经纤维及螺旋度受损，CO 构架尚在；C. 给药后 6 周 CO 结构基本塌失，，支持细胞明显损伤并基本消失，SGN 严重损伤；D毛细胞和支持细胞完全丧失，整个基底膜为一层扁平上SGN 严重缺失。标尺：AB 分别为 20 μm，CD 为 40 μm11

耳蜗损伤,阿米卡星,扫描电镜,外毛细胞

图 3：阿米卡星对幼年大鼠耳蜗损伤作用的形态学观察（扫描电镜）A. 正常大鼠耳蜗基底膜。I 为内毛细胞，呈一字形整齐排列；O 为外毛细胞，呈 V 型排列；P 为支持细胞。B. 给药 6 周后，基底膜内、外毛细胞完全丧失。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R764

【参考文献】