【摘要】：研究目的： 1.探讨恒温烧灼条件下制作兔角膜重度热烧伤(severe corneal thermal burn, SCTB)模型的最佳参数。 2.探讨角膜热烧伤后不同时间基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(natrix metalloproteinase-9, MMP-9)在角膜上清液和房水的浓度变化与角膜损伤程度的关系。 3.探讨兔SCTB早期接受穿透性角膜移植术(penetrating keratoplasty, PKP)的最佳时机,探讨手术效果与角膜组织上清液MMP-2和MMP-9浓度的关系。 4.探讨模拟角膜远程投送(long distance transportation, LDT)技术在兔SCTB行PKP治疗中应用的安全性和实用性。 研究方法： 1.成年健康新西兰大白兔36只,雌雄不限,体重2.0-2.5kg。随机分为A、B、C、D4组,每组9只(18眼),各组分别设定不同的制模烧灼温度100℃、200℃、300℃、400℃。每组在制模时设定3个不同的的烧灼时间4s、7s、10s。各组内每个烧灼时间对3只新西兰大白兔(6眼)进行制模。观察各组制模后角膜的烧伤程度、角膜烫伤区形态,以及在制模后观察期内角膜组织发生溶解或穿孔的眼数,根据角膜烧伤程度进行量化评分,统计学分析烧灼温度、烧灼时间与角膜烧灼程度的关系,根据兔SCTB的判定标准(烧伤程度达到Ⅲ-Ⅳ度),确定兔SCTB模型制作的最适合烧灼温度和烧灼时间。烫伤后3d将实验动物处死,对制模后不同烧伤程度的角膜行免疫组化HE染色,观察本实验条件下制作的兔角膜热烧伤模型是否符合标准角膜热烧伤分级的角膜损伤程度。 2.健康的成年新西兰大白兔21只,雌雄不限,体重2.0-2.5kg,随机分为7组：A组：正常对照组；B组：2h组；C组：6h组；D组：12h组；E组：24h组；F组：48h组；G组：72h组。每组3只(6眼),除正常对照组,其余6组新西兰大白兔双眼制作SCTB模型。分别在成功制模后2h、6h、12h、24h、48h、和72h按分组处死实验动物,自角膜缘穿刺抽取双眼房水0.3mL,自角膜缘切口取双眼角膜,角膜沿垂直中轴线分为2等份,1份角膜组织匀浆后离心,取上清液,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测各组角膜组织上清液和房水中MMP-2和MMP-9的浓度。另一份免疫组化染色法(immunohistochemistry, IHC)检测MMP-2和MMP-9在热烧伤后角膜组织中的表达。 3.健康的成年新西兰大白兔48只,按热烧伤后接受PKP治疗的时间不同,随机分为4组,每组12只,所有实验动物左眼制作SCTB模型。A组：烧伤后12h行PKP治疗；B组：烧伤后24h行PKP治疗；C组：烧伤后48h行PKP治疗；D组：烧伤后72h行PKP治疗。48只新鲜供体角膜均取自健康的成年新西兰大白兔。观察术后角膜植片成活情况、角膜植片透明程度、角膜植片新生血管生长情况。每组分别在PKP术后20d、40d各随机选择6只实验动物处死,取术眼角膜和房水,角膜按垂直中轴线分为2等份,ELISA检测角膜组织上清液和房水中MMP-2和MMP-9的浓度,IHC检测角膜植片部位MMP-2和MMP-9的表达。 4.取自健康成年新西兰大白兔的供体角膜30只,随机分为A、B、C、D、E组5组,每组6只,A组：正常对照组；B、C组：供体角膜单纯湿房法保存24h；D、E组：供体角膜湿房保存并进行角膜LDT模拟24h。A、B、D组供体角膜用环钻钻取中央部角膜,自垂直中线分成2份,ELISA检测钻取部分角膜组织上清液MMP-2和MMP-9的浓度,IHC检测钻取部分角膜组织中MMP-2和MMP-9的表达。环钻钻取后剩余角膜内皮台盼蓝-茜素红染色,角膜内皮细胞密度计数。观察湿房法保存及模拟角膜LDT后角膜内皮密度及MMP-2和MMP-9在角膜组织上清液的浓度以及在角膜组织内的表达。健康成年新西兰大白兔12只,随机分为F、G两组,每组6只,左眼制作SCTB模型并在角膜烧伤后24h行PKP治疗。F组：供体角膜为C组角膜,G组：供体角膜为E组角膜。术后40d观察两组实验动物术眼角膜植片透明程度,测量角膜植片新生血管面积。术后40d处死实验动物,取角膜植片沿垂直正中线分为2份,ELISA检测角膜组织上清液MMP-2和MMP-9的浓度,IHC检测角膜植片部位MMP-2和MMP-9的表达。 研究结果： 1.不同的烧灼温度和烧灼时间,造成角膜热烧伤的程度不同。当烧灼温度≥300℃,烧灼时间≥7s时,可达到重度热烧伤的制模条件。烧灼温度达到400℃,易造成角膜组织焦化,烧灼时间超过7s时易造成角膜烧伤区边界不清。烧灼温度300℃,烧灼时间7s时制模较理想。IHC结果显示本实验条件下制作的兔角膜热烧伤模型符合标准角膜热烧伤分级的角膜损伤程度：角膜轻度热烧伤仅角膜上皮层受损,中度热烧伤角膜上皮层和浅基质层受损,重度热烧伤全层角膜组织受损。 2.与正常组相比较,角膜组织上清液中MMP-2和MMP-9的浓度在SCTB制模后12h明显增高,在烧伤后24h达到高峰,并一直持续高浓度状态至烧伤后72h(P0.01)。烧伤后2h和6h与正常角膜比较无显著性差异(P0.05),烧伤后12h与24h比较有显著差异(P0.05),而烧伤后24h、48h、和72h比较无显著性差异(P0.05)。房水中MMP-2和MMP-9的浓度在角膜热烧伤后24h明显增高,并一直持续高浓度状态至烧伤后72h(P0.01)。烧伤后2h、6h、12h比较无显著性差异(P0.05),12h与24h比较有显著差异(P0.01),24h、48h和72h比较无显著性差异(P0.05)。IHC检测显示在角膜热烧伤后2h时,MMP-2在角膜基质全层出现表达,并且随着受伤时间的延长,表达强度逐渐增加,24h及以后出现强阳性表达。MMP-9在角膜烧伤2h时基底细胞层出现表达,并逐渐向基质层扩展,6h时浅层基质出现表达,24h后全基质层出现强阳性表达。 3.兔SCTB经PKP治疗,术后所有角膜植片均成活,SCTB制模后接受PKP手术治疗时间不同,术后20d和40d角膜植片透明程度有明显差异(P0.01)。A、B组的角膜植片新生血管面积明显小于C、D组(P0.01)。术后20d和40d角膜组织上清液MMP-2和MMP-9的浓度A、B组明显小于C、D组(P0.01),各组房水中MMP-2和MMP-9的浓度无显著性差异(P0.05)。IHC检测结果显示：A、B组角膜植片基质层纤维排列相对整齐、致密,C、D组角膜植片基质层纤维排列不整齐,结构紊乱。所有各组角膜组织切片中MMP-2和MMP-9在各层角膜组织中均见阳性表达,C、D组呈强阳性表达。 4.经湿房保存以及角膜LDT模拟24h后,B、D组角膜与A组角膜内皮细胞密度计数无显著性差异(P0.05),角膜组织上清液MMP-2和MMP-9的浓度无显著性差异(P0.05),IHC检测MMP-2和MMP-9未见明显表达。F、G组实验动物SCTB制模24h接受PKP治疗后所有植片成活,术后40d时两组角膜植片新生血管以及透明程度均无显著性差异(P0.05),角膜组织上清液中MMP-2和MMP-9的浓度无显著性差异(P0.05)。IHC检测MMP-2和MMP-9在角膜植片全层呈阳性表达。 结论： 1.恒温条件下建立兔角膜热烧伤模型,其烧灼温度越高,烧灼时间越长,角膜烧伤程度越重。确定兔SCTB模型制作最佳参数为：烧灼温度300℃,烧灼时间7s。恒温烧灼条件制作兔SCTB模型效果良好,能够达到全层角膜组织损伤的标准。 2.MMP-2和MMP-9在兔SCTB制模后24h表达同时达到高峰,此时角膜组织的损害明显加重,MMP-2和MMP-9均参与了兔SCTB角膜损伤过程,与热烧伤后角膜组织的损伤溶解关系密切。 3.兔SCTB制模后24h内接受穿透性角膜移植术治疗,能够取得较好的治疗效果。术后角膜组织上清液MMP-2和MMP-9的浓度与手术治疗效果关系密切。MMP-2和MMP-9可能参与了术后角膜植片的修复过程,其高表达可能加重了术后角膜植片的损伤作用。 4.采用湿房法保存角膜经LDT提供的供体角膜质量可靠,对兔SCTB后接受PKP治疗的手术效果无明显影响。LDT在兔SCTB早期角膜移植手术中的应用安全、可靠,由此推断,LDT技术能够为SCTB的PKP手术急救治疗提供供体角膜,在临床治疗中有良好的应用价值。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R779.65
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本文编号：
2546903
