FoxO1在糖尿病大鼠视网膜和视网膜内皮细胞IL-1β诱导的自刺激中的作用及其机制

发布时间：2017-03-19 08:01

  本文关键词：FoxO1在糖尿病大鼠视网膜和视网膜内皮细胞IL-1β诱导的自刺激中的作用及其机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景与目的糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy,DR)是糖尿病的微血管并发症,也被认为是一种慢性低度炎症性疾病。在糖尿病的早期阶段,DR的特征是视网膜屏障(the blood-retinal barrier,BRB)的破坏,而组成内层视网膜屏障的主要部分是内皮细胞,并且随着糖尿病病程的延长,内皮细胞死亡数目增加。除内皮细胞死亡外,炎症介质也会通过激活细胞内信号增加血管通透性。炎症因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的水平在糖尿病患者和动物模型的视网膜、玻璃体和血清中升高,还能以旁分泌和自分泌的方式诱导自身的合成,加速并扩大糖尿病视网膜中的炎症级联反应。叉头状转录因子O1(Forkhead transcription factor,Fox O1)是叉头状转录因子O亚家族中重要的一员,在调控增殖凋亡、氧化应激、调节自噬和分化等方面发挥重要作用。研究发现,在1型和2型糖尿病大鼠模型的视网膜中,Fox O1的活性增加,并伴随着炎症反应和凋亡增加。因此推测DR状态下Fox O1活性增加可能与炎症有一定的联系,但Fox O1调节内皮细胞功能的具体机制尚不清楚。研究发现,在原代大鼠肝细胞和HEK293细胞中,IL-1β通过刺激IL-1受体过表达导致胞质和核内Fox O1蛋白量增加。而在巨噬细胞中,Fox O1直接结合到IL-1β启动子上,促进IL-1β的表达增加。因此推测,IL-1β在视网膜内皮细胞中可刺激Fox O1表达增加,从而促进IL-1β的表达增加。本实验以Fox O1特异性小干扰RNA(si RNA)慢病毒载体下调内皮细胞和STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜中的Fox O1的表达及活性,观察Fox O1在IL-1β诱导的自刺激中的作用,并探讨其机制。方法原代人视网膜血管内皮细胞(HRMECs)培养于不同糖浓度(5.6、15、25、35mmol/L)24h后,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和Western blotting法检测Fox O1、IL-1β的表达。HRMECs培养于重组人白介素-1β(r IL-1β)的不同浓度(0、1、2.5、10、25、100ng/m L)24h后,Real-time PCR、Western blotting检测处理后细胞的Fox O1、IL-1β、Caspase-8表达,细胞免疫荧光检测处理后细胞中Fox O1的表达分布,流式细胞仪检测不同浓度r IL-1β处理后HRMECs的凋亡率。HRMECs培养于IL-1受体阻断剂(IL-1RA)、MAPK阻断剂(U0126、SB203580、SP600125)中伴或不伴r IL-1β(10ng/m L),Western blotting法检测Fox O1、p-ERK、p-P38、p-JNK的表达。将构建的Fox O1特异性小干扰RNA(si RNA)慢病毒载体及空慢病毒载体(LV-NC)转染于正常培养的HRMECs,转染后的细胞经或不经过r IL-1β(10ng/m L)刺激24h后,Real-time PCR、Western blotting法检测Fox O1、IL-1β的表达。40只SPF级雄性SD大鼠,随机选取其中30只构建糖尿病大鼠模型,10只作为正常对照组(NC组)。糖尿病造模成功后,将成模糖尿病大鼠随机分为3组:糖尿病组(DM组),糖尿病Fox O1干扰转染组(LV-si-Fox O1组)和糖尿病空病毒转染组(LV-NC组)。大鼠麻醉后,在解剖显微镜下玻璃体注射Fox O1特异性小干扰RNA(si RNA)慢病毒载体及空慢病毒载体(LV-NC)10μl,涂抹抗生素软膏以保护角膜。于病毒注射后4周、8周、12周末,称体重(Body Weight,BW),尾静脉取血测血糖。12周末水合氯醛麻醉大鼠,迅速剥离出眼球,置于4%多聚甲醛中固定用于HE染色和免疫组化检查,于4%预冷戊二醛固定用于电子显微镜检查。新鲜眼球,去除眼前节,分离出视网膜,迅速于液氮中冷冻,荧光定量PCR和Western bloting检测Fox O1、IL-1β表达。结果1.高糖诱导HRMECs的Fox O1和IL-1β表达增加:Fox O1和IL-1β蛋白和m RNA的表达水平随着葡萄糖浓度的增加而增加,特别是糖浓度在35mmol/L时候显著升高(P0.05)。2.r IL-1β诱导HRMECs的早期凋亡是浓度依赖性,但并不依赖Caspase-8的表达:正常培养的HRMECs早期凋亡率是0.5%,而培养于不同浓度(1、2.5、10、25、100ng/m L)的r IL-1β后,凋亡率分别增加为5.3%,6.6%,8.1%,8.3%,12.6%。不同浓度的r IL-1β对HRMECs的Caspase-8蛋白表达水平无明显影响(P0.05)。3.不同浓度r IL-1β诱导HRMECs的Fox O1和IL-1β表达增加:与对照组相比,Fox O1和IL-1βm RNA及蛋白的表达水平随着r IL-1β浓度的增加而明显增加(均P0.05);细胞免疫荧光化学提示随着r IL-1β浓度的增加,Fox O1在细胞核内和胞质内的表达增加,在r IL-1β浓度为25和100ng/m L时,表达显著增加(P0.05)。4.IL-1受体阻断剂(IL-1RA)、MAPK阻断剂(U0126、SB203580、SP600125)减少r IL-1β诱导HRMECs的Fox O1表达:IL-1RA可减少r IL-1β诱导HRMECs的Fox O1和IL-1β表达。r IL-1β可激活细胞的磷酸化MAPK(p-ERK、p-P38、p-JNK),而IL-1RA可以阻断r IL-1β诱导的MAPK的磷酸化。另外,MAPK阻断剂也可抑制r IL-1β诱导的Fox O1蛋白表达。5.LV si-Fox O1慢病毒转染细胞后,r IL-1β诱导转染细胞的Fox O1和IL-1β表达减弱:HRMECs为原代细胞,流式检测转染组和空载组的转染效率分别是68.1%和58.5%。与正常组相比,IL-1β组和LV-NC+IL-1β组Fox O1和IL-1β表达都明显增加(P0.001);与10ng/ml r IL-1β组相比,r IL-1β+LV si-Fox O1组Fox O1的m RNA表达水平降低,但仍有统计学意义(P0.05),而r IL-1β+LV si-Fox O1组IL-1β的m RNA水平则显著降低(P0.001)6.在大鼠视网膜中,慢病毒转染可下调Fox O1和IL-1β表达:与NC组相比,DM组Fox O1和IL-1β蛋白和m RNA表达水平显著增加(P0.05),而LV-si-Fox O1组Fox O1和IL-1β表达无统计学意义(P0.05)。免疫组化结果显示,DM组Fox O1和IL-1β免疫染色较NC组显著增加,LV-si-Fox O1组免疫染色则不显著,Fox O1免疫染色主要分布外网状层、内核层、内网状层和神经节细胞层,IL-1β免疫染色在视网膜全层表达增加。电镜结果显示正常组内皮细胞线粒体形态正常,官腔未变形。DM组和LV-NC组内皮细胞线粒体明显肿胀,可见空泡变性,管腔明显狭窄。LV-si-Fox O1组内皮细胞线粒体轻度肿胀,官腔未见明显变形。结论1.在HRMECs中IL-1β通过IL-1受体激活MAPK,并促进Fox O1表达,进而上调IL-1β。2.在糖尿病大鼠视网膜中,下调Fox O1的表达可降低视网膜IL-1β的表达,减轻视网膜炎症。
【关键词】：叉头状转录因子O1 糖尿病视网膜病变 原代人视网膜血管内皮细胞 炎症 白介素-1β
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2;R774.1
【目录】：

• 摘要4-8
• Abstract8-14
• 中英文缩略词14-16
• 前言16-18
• 1 材料与方法18-31
• 2 结果31-36
• 3 讨论36-40
• 4 结论40-41
• 附图41-46
• 参考文献46-49
• 综述 糖尿病视网膜病变和炎症的关系49-65
• 参考文献57-65
• 个人简历65-66
• 致谢66-67

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 宁国润;;低密度脂蛋白胆固醇与视网膜病的严重性有关[J];中国人民解放军军医进修学院学报;1982年04期

2 王伟琴;;血小板与视网膜病[J];中国人民解放军军医进修学院学报;1982年02期

3 李玉琴，，宁宏;干扰素性视网膜病[J];日本医学介绍;1995年03期

4 曹向阳;黎蕾;;糖尿病性视网膜病变中血视网膜屏障损伤机制研究进展[J];中国眼耳鼻喉科杂志;2006年02期

5 车松天;王桂云;隋桂琴;李旭;;微量全氟加萘对家兔视网膜毒性作用的剂量关联性[J];吉林大学学报(医学版);2007年04期

6 汤国雄;;二硫化碳引起视网膜病的流行病学研究,二硫化碳接触水平与视网膜病的发展[J];广医通讯;1977年03期

7 Mark.O.M.Tso;张惠容;;血—视网膜屏障的病理[J];眼科新进展;1983年02期

8 管怀进;视网膜病的基础和临床研究[J];南通医学院学报;1998年03期

9 徐国兴;;视网膜病国内外研究现状与进展[J];医学研究杂志;2014年02期

10 邓娜,王学民,曹红宝;人体视网膜图像的提取[J];医疗卫生装备;2004年09期

中国重要会议论文全文数据库 前6条

1 戴仪;王一雪;石文静;陈超;;重组人色素上皮衍生因子对氧诱导视网膜病新生血管的抑制作用[A];中华医学会第十五次全国儿科学术大会论文汇编（上册）[C];2010年

2 范玉华;陈玲;曾进胜;裴中;;遗传性内皮细胞病伴视网膜病、周围神经病和脑病-病例报告[A];第十一届全国神经病学学术会议论文汇编[C];2008年

3 丁格林;丁乡客;苏红玉;;中西医结合治疗视网膜静脉周围炎(附11例报告)[A];全国首届中青年中医眼科学术研讨会资料汇编[C];1996年

4 向圣锦;郜忠海;林宝仁;黄新平;;Coats病临床特征分析[A];浙江省中医药学会眼科分会2008继续教育研讨会论文集[C];2008年

5 廖品正;;中医对糖尿病视网膜病变的治疗[A];糖尿病（消渴病）中医诊治荟萃——全国第五次中医糖尿病学术大会论文集[C];1999年

6 张学东;李波;;促红细胞生成素在早期糖尿病大鼠视网膜表达的研究[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年

中国重要报纸全文数据库 前7条

1 记者郑晓春;传统矫正儿童近视方法欠妥[N];科技日报;2002年

2 郭卿哲;何为中心性浆液性视网膜病[N];中国医药报;2001年

3 胡永秋;研究发现超重或肥胖可能引起眼疾和失明[N];农村医药报（汉）;2008年

4 网侃;戴近视镜不是矫正近视的正确方法[N];市场报;2003年

5 本报记者 白轶南;早期症状不重视 待到治疗已无望[N];保健时报;2005年

6 刘国信;给婴儿拍照不宜用闪光灯[N];中国医药报;2004年

7 谢明霞;用药谨防眼睛受伤害[N];科技日报;2006年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 李蓉;早产对大鼠视网膜发育及氧诱导视网膜病变的影响[D];第四军医大学;2013年

2 陈虹霞;532nm激光对兔视网膜生物效应的实验及理论研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2005年

3 杨军;早产儿视网膜病变基础和临床研究[D];第一军医大学;2007年

4 石文静;吸氧和血管生长因子在新生小鼠视网膜病发病中的作用[D];复旦大学;2004年

5 王玉环;不同吸氧方式在新生小鼠视网膜病变发病中的作用[D];复旦大学;2006年

6 刘新玲;氧诱导小鼠视网膜病变定量蛋白质组研究[D];天津医科大学;2007年

7 孙康明;高性能视网膜修复芯片的研究[D];重庆大学;2010年

8 范聪;抗VEGF药物贝伐单抗对视网膜安全性的实验研究[D];北京协和医学院;2010年

9 刘燕;不同光环境对兔眼球发育的影响及中药干预作用的研究[D];南京中医药大学;2015年

10 胡宝洋;氧诱导视网膜病的基因表达谱及细胞分子生物学机制研究[D];复旦大学;2004年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 吴炀;FoxO1在糖尿病大鼠视网膜和视网膜内皮细胞IL-1β诱导的自刺激中的作用及其机制[D];郑州大学;2015年

2 李晓琴;炎症对大鼠氧诱导视网膜病变的影响[D];第四军医大学;2015年

3 蔺涛;脂联素及其受体在正常人和1型糖尿病小鼠视网膜中的表达[D];重庆医科大学;2013年

4 时佳佳;视网膜症状性渗出液相关紊乱的自动化分割与定量分析研究[D];南京理工大学;2014年

5 李娟;缬沙坦对糖尿病大鼠视网膜内皮素-1 表达的影响及其机制的研究[D];中国医科大学;2009年

6 李萌;高压氧与高浓度氧对新生小鼠视网膜和肺损伤作用的区别[D];中南大学;2009年

7 卜立敏;葡萄糖转运蛋白-1在糖尿病早期大鼠视网膜的表达[D];中国医科大学;2008年

8 陈莎丽;高压氧对胎兔和新生兔视网膜影响的形态学与体视学分析[D];暨南大学;2005年

9 孙庆艳;猫视网膜年龄相关的形态学变化研究[D];安徽师范大学;2005年

10 张文静;水通道蛋白4基因敲除对视网膜光损伤的影响[D];南京医科大学;2009年

  本文关键词：FoxO1在糖尿病大鼠视网膜和视网膜内皮细胞IL-1β诱导的自刺激中的作用及其机制，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：255725