189-目标捕获芯片在遗传性视网膜疾病的应用
发布时间：2019-11-16 01:12
【摘要】：一、中国人群遗传性视网膜疾病基因诊断平台的建立目的分析26个中国人群遗传性视网膜疾病(Hereditary retinal diseases,HRDs)家系的临床特征,探讨其遗传学基础,初步建立HRDs基因诊断平台。方法对参与研究的所有家系成员进行详细的眼科检查。选择美国Roche公司的2.1 MNimbleGen序列捕获芯片,目标区域覆盖179个已知HRDs发病相关基因和10个预测剪接基因的所有外显子区域。结合新一代测序技术(Next-generation sequencing,NGS)对收集的26个多种临床表型的HRDs家系进行目标区域捕获测序,数据经分析滤过,获得候选突变进行Sanger直接测序验证和致病性评估。结果NGS数据经分析滤过、Sanger直接测序验证和致病性评估后,明确4个已知突变,2个复合突变和9个新突变。9个新突变中5个为严重的无义或移码突变,4个为错义突变。26个HRDs家系中有15个家系明确致病突变,检出率为57.7%。其中一个位于VCAN基因的已知剪接位点突变,有力解释了其相应家系的复杂临床表型,帮助确诊为Wagner综合征。剩余家系中,有5个家系获得11个候选可能致病突变。结论HRDs具有显著的遗传和临床异质性,大量的潜在新致病基因和致病突变有待发现。本研究证实结合NGS技术的目标区域捕获测序,能够经济有效地检测临床表型多样化的HRDs病例,更好地解释疾病基因型与表型之间的关系,初步建立中国人群HRDs基因诊断平台。二、常染色体显性视网膜色素变性家系视紫红质基因的研究目的探讨两个位于视紫红质(Rhodopsin,RHO)基因的杂合错义突变引起常染色体显性遗传视网膜色素变性(Autosomal dominant retinitis pigmentosa,adRP)的细胞学机制。方法选择带有绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)的真核质粒载体pEGFP-N1,利用重叠PCR法构建RHO~(WT)野生型,RHO~(L95P)和RHO~(P53R)两种突变型质粒。将3种质粒转染人视网膜色素上皮细胞系(ARPE 19)和人肾胚293细胞系(HEK293),观察3种类型视紫红质-GFP融合蛋白在细胞内的定位;采用蛋白印迹法(Western blot)检测内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)关键因子X盒结合蛋白1(X box-binding protein-1,XBP1)的表达。结果 3种类型质粒转染ARPE 19细胞24小时,细胞免疫荧光(Immunofluorescence,IF)显示,与野生型相比,两种突变型视紫红质-GFP融合蛋白均积聚在红色的内质网上,不能有效向细胞膜转运。此外,与转染RHO~(WT)野生型细胞相比,转染RHO~(L95P)和RHO~(P53R)两种突变型质粒的HEK293细胞中,XBP1在信使核糖核酸(Messenger ribonucleic acid,mRNA)水平均被特异性剪切26个碱基的内含子,发生活化,且XBP1蛋白水平表达高于转染野生型、转染空pEGFP-Nl质粒细胞及未转染细胞。结论 RHO p.L95P和RHO p.P53R均属于Ⅱ类突变,该突变类型的视紫红质蛋白不能有效地从内质网向细胞膜转运,蓄积在内质网,引起蛋白折叠错误,发生 ERS。第三部分:一个复杂表型中国汉族HRD家系的纯合定位目的分析一个具有复杂眼部表型的中国汉族HRD家系的临床特点,确定其遗传学基础,探讨基因型与表型之间的关系。方法对参与研究的所有家系成员进行详细的眼科检查。利用NGS技术对该家系先证者进行189-目标捕获芯片的目标区域捕获测序,数据经分析滤过,候选突变进行Sanger直接测序验证和致病性评估。在获得一个位于BEST1基因上的可能致病突变后,对该家系进行11号染色体的纯合定位,以期明确在纯合区域内是否尚存其他致病基因与该家系的复杂表型相关。结果数据经分析滤过后获得唯一可能致病突变BEST1c.752GA(p.C251Y),Sanger直接测序验证该错义突变在该家系中呈共分离。所有的5例患者均为纯合子,临床表型基本一致,眼底呈现典型常染色体隐性BEST病(Autosomal-recessive bestrophinopathy,ARB)样黄斑病变,同时有闭角型青光眼(Angle-closure glaucoma,ACG)和白内障,而杂合子携带者表型正常。251号氨基酸位于Bestrophin-1蛋白第5跨膜螺旋结构内,在哺乳动物中高度保守。11号染色体的纯合定位显示该家系所有患者共享包括BEST1p.C251Y点突变在内的纯合区域,Sanger直接测序位于此区域内的另外两个与HRDs发病相关基因,未发现致病突变。结论BEST1P.C251Y很可能是该HRD家系的致病突变,11号染色体上包括BEST1 p.C251Y点突变在内的纯合区域与该家系临床表型相关,所有患者均表现为ARB、ACG和白内障。结合NGS技术的目标区域捕获测序,能够经济有效地检测临床表型复杂的HRD病例,协助临床诊断与治疗。
【图文】：
逦天津医科大学博±学位论文逦逡逑异性探针，杂交探针长度２５０？３００邋ｂｐ，覆盖１８９个基因的４，６４１个外显子，，包括逡逑外显子和内含子拼接处１００邋ｂｐ和５’、３’非编码区域（Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ邋ｒｅｇｉｏｎｓ，邋ＵＴＲ），逡逑不包括重复序列，避免捕获假基因，该目标区域捕获芯片命名为：１８９－目标捕获逡逑花片（图２）。结合Ｉｌｌｕｍｉｎａ邋Ｓｏｌｅｘａ测序平台的最新高通量测序仪Ｉｌｌｕｍｉｎａ邋ＨｉＳｅｑ？逡逑２０００，对２６个ＨＲＤｓ家系的３１例患者及４例正常成员的全基因组ＤＮＡ样本进逡逑行目标区域捕获测序。数据经分析滤过，候选突变进行Ｓａｎｇｅｒ直接测序验证和逡逑致病性评估。逡逑
、中国人群遗传性视网膜疾病基因诊断平台的建立逡逑Ｄ．邋１８９－目标捕获芯片结合ｎｉｕｍｉｎａ邋Ｈ设ｅｑ？邋２０００高通量测序逡逑３５例样本目标区域捕获测序由北京华大基因完成［３９１，实验步骤如下（图３）；逡逑ＮＧＳ测序逡逑全基因组ＤＮＡ逦前己Ｇ逡逑吗怳二骑ＸＧＣ仍Ｔ巧ＧＧ的应逡逑ｒｘ逦．，萌ＳＣＣＫＧＴＡＣＡＡＣ邋了岳k纬煎义希族沃柿考觳忮伟隋义希模危铃迤位巍蝈义希停停蓿蓿牛铮睿铃危В村澹颍颍翦蜗咝岳┰鲥义希龋蓿簦蓿牛铮睿渝畏縸岧逡逑}保辏牛铮铄澹缅危掊澹慑錼>逡逑ｏ逦＇Ｉub逡逑连接特异性接头逦八逡逑＾逦与目标芯片杂交逦富集目标ＤＮＡ逡逑Ｖ寒．＼灥；．．淡邋Ｉ媭f巍鲥义希场颂砑渝危掊澹危苠澹鹤ǎ还椋撸撸簦В⒍义希ⅲ粒⒓罨澹蝈澹掊危郑㈠澹у尉溴义希掊我诲澹辏海肯赐驯尘板义蠆隋澹模危铃义贤迹常危椋恚猓欤澹牵澹钚蛄胁痘裥酒岷希桑欤欤酰恚椋睿崧剑樱澹瘢浚玻埃埃案咄坎庑虻氖笛榱鞒淌疽馔肌ｅ义希ㄍ计淖藻澹瑁簦簦穑海鳎鳎鳎睿椋恚猓欤澹纾澹睿悖铮恚╁义希ǎ保
本文编号：2561580
【图文】：
逦天津医科大学博±学位论文逦逡逑异性探针，杂交探针长度２５０？３００邋ｂｐ，覆盖１８９个基因的４，６４１个外显子，，包括逡逑外显子和内含子拼接处１００邋ｂｐ和５’、３’非编码区域（Ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ邋ｒｅｇｉｏｎｓ，邋ＵＴＲ），逡逑不包括重复序列，避免捕获假基因，该目标区域捕获芯片命名为：１８９－目标捕获逡逑花片（图２）。结合Ｉｌｌｕｍｉｎａ邋Ｓｏｌｅｘａ测序平台的最新高通量测序仪Ｉｌｌｕｍｉｎａ邋ＨｉＳｅｑ？逡逑２０００，对２６个ＨＲＤｓ家系的３１例患者及４例正常成员的全基因组ＤＮＡ样本进逡逑行目标区域捕获测序。数据经分析滤过，候选突变进行Ｓａｎｇｅｒ直接测序验证和逡逑致病性评估。逡逑
、中国人群遗传性视网膜疾病基因诊断平台的建立逡逑Ｄ．邋１８９－目标捕获芯片结合ｎｉｕｍｉｎａ邋Ｈ设ｅｑ？邋２０００高通量测序逡逑３５例样本目标区域捕获测序由北京华大基因完成［３９１，实验步骤如下（图３）；逡逑ＮＧＳ测序逡逑全基因组ＤＮＡ逦前己Ｇ逡逑吗怳二骑ＸＧＣ仍Ｔ巧ＧＧ的应逡逑ｒｘ逦．，萌ＳＣＣＫＧＴＡＣＡＡＣ邋了岳k纬煎义希族沃柿考觳忮伟隋义希模危铃迤位巍蝈义希停停蓿蓿牛铮睿铃危В村澹颍颍翦蜗咝岳┰鲥义希龋蓿簦蓿牛铮睿渝畏縸岧逡逑}保辏牛铮铄澹缅危掊澹慑錼>逡逑ｏ逦＇Ｉub逡逑连接特异性接头逦八逡逑＾逦与目标芯片杂交逦富集目标ＤＮＡ逡逑Ｖ寒．＼灥；．．淡邋Ｉ媭f巍鲥义希场颂砑渝危掊澹危苠澹鹤ǎ还椋撸撸簦В⒍义希ⅲ粒⒓罨澹蝈澹掊危郑㈠澹у尉溴义希掊我诲澹辏海肯赐驯尘板义蠆隋澹模危铃义贤迹常危椋恚猓欤澹牵澹钚蛄胁痘裥酒岷希桑欤欤酰恚椋睿崧剑樱澹瘢浚玻埃埃案咄坎庑虻氖笛榱鞒淌疽馔肌ｅ义希ㄍ计淖藻澹瑁簦簦穑海鳎鳎鳎睿椋恚猓欤澹纾澹睿悖铮恚╁义希ǎ保
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