人喉癌细胞异质性研究及喉癌干细胞标志的初选

发布时间：2019-11-19 05:36

【摘要】：目的:1.通过原代培养人喉癌实体瘤细胞,克隆分离异质性细胞亚群,筛选出肿瘤干细胞样细胞亚群。 2.比较喉癌肿瘤干细胞样亚群与不同细胞亚群细胞表面标记物表达的差异,初步筛选人喉癌实体瘤干细胞的细胞表面标记物。方法:1.原代培养人喉癌实体瘤细胞,组织标本取材于山西医科大学第一附属医院耳鼻喉科15例诊断为喉鳞状细胞癌患者的新鲜实体瘤手术标本。 2.应用有限稀释法对体外培养的喉癌细胞进行单细胞克隆培养,分离异质性亚群,选取其中形态差别最大的两个克隆集落命名为1型和2型细胞亚群,分别进行下述实验。I型和2型亚群细胞继续进行单细胞亚克隆培养。比较其在形态及分化能力方面的差异。 3.MTT(甲基噻唑基四唑)法检测1型和2型亚群细胞的增殖活性;流式细胞仪检测两亚群细胞增殖周期;两型细胞分别裸鼠移植检测其成瘤能力。 4.应用免疫荧光细胞化学技术定性的观察1型和2型亚群细胞表面标记物的表达情况;流式细胞技术定量的检测两型亚群细胞表面标记物CD133、CD44的表达。5.所有数据采用均数±标准差表示,SPS统计软件包进行t检验,以P0.05作为差异显著性标准。结果:1.喉癌实体瘤细胞分离得到1型和2型细胞形态差异最大的两个亚群。1型细胞成长梭形,突起少,亚克隆培养未产生子代细胞;2型细胞成多角形,多突起,继续培养产生的子代克隆出现异质性细胞。 2.MTT法检测两型细胞的增值能力,2型亚群细胞在接种5天后显示出比1型细胞更强的增值活性。 3.流式细胞仪测定DNA相对含量,确定细胞各时相所占的百分率。大部分2型细胞处在G0/G1期,显著高于1型细胞,经t检验由显著差异(P0.05)。 4.1型肿瘤细胞种植6周后裸鼠皮下未见瘤体形成(0/5);2型肿瘤细胞裸鼠皮下种植2周后形成瘤体,成瘤率为100%(5/5)。2型亚群细胞亚克隆的子代多角形细胞种植到裸鼠皮下,成瘤率也达100%(5/5);而1型子代梭形细胞种植到裸鼠皮下未见成瘤。体外增值能力强,处于细胞周期G0/G1的比例明显高于1型细胞,是具有肿瘤干细胞特性的亚群。 5.经细胞免疫荧光化学染色结果显示1型亚群细胞中CD44-FITC、CD133-FITC染色均为阴性;2型亚群细胞CD44-FITC染色强阳性,布满爬片,CD133-FITC染色恒量阳性,与2型细胞一定量的结合,均表达为细胞周缘绿色强荧光。 6.流式细胞技术示CD44、CD133在1型亚群细胞不表达;2型亚群细胞中,95.1%±2.3%的细胞表达膜抗原CD44,23.8%±1.7%的细胞表达膜抗原CD133。与细胞免疫荧光化学技术的结果吻合。结论:1.原发性人喉癌实体瘤细胞具有异质性,存在着肿瘤干细胞样亚群。在本实验中,2型亚群细胞具有肿瘤干细胞生物学特性。 2.膜抗原CD133、CD44可作为喉癌干细胞的表面标记物。
【图文】：

形态学特点,原代培养,细胞体积,刚接

1 喉癌细胞形态学特征喉癌细胞刚接种入培养瓶时倒置显微镜下观察，细胞有明显的肿瘤细胞特征，大部分细胞体积大呈圆形，胞质丰满透明，细胞核大或双核（图1a）；经含5％胎牛血清培养液培养并反复纯化后呈现为典型的上皮细胞形态学特点：细胞贴壁生长,略呈梭形,细胞长满培养瓶时呈“铺路石”状（图1b）。角蛋白细胞化学染色结果为：部分肿瘤细胞核被染成棕黄色，大部分细胞质内可见棕黄色颗粒，说明经原代培养的绝大多数肿瘤细胞为角蛋白阳性，符合上皮细胞来源（图1c），排除成纤维细胞、内皮细胞等。证实培养的细胞为喉癌上皮细胞。图 1 原代培养喉癌细胞形态学特点 1a 刚接种时细胞体积大呈圆形，胞质丰满透明 ×400；1b 细胞贴壁生长,略呈长梭形,长满时呈“铺路石”状 ×400； 1c 喉癌细胞中角蛋白的细胞化学染色结果SP 法检测角蛋白在喉癌细胞中呈阳性表达，胞质和胞核内可见棕黄色颗粒 DAB 显色 ×4002 1型和2型亚群细胞的形态学特点常规培养 72 小时，，相差显微镜下观察，1 型细胞长梭形，突起较少（图 2A）；2 型细胞多角形

亚群,聚集生长,细胞,多角形

1 原代培养喉癌细胞形态学特点 1a 刚接种时细胞体积大呈圆形，胞质丰满透明 ×400；1b贴壁生长,略呈长梭形,长满时呈“铺路石”状 ×400； 1c 喉癌细胞中角蛋白的细胞化学染色SP 法检测角蛋白在喉癌细胞中呈阳性表达，胞质和胞核内可见棕黄色颗粒 DAB 显色 ×4001型和2型亚群细胞的形态学特点常规培养 72 小时，相差显微镜下观察，1 型细胞长梭形，突起较少（图 2A）；2 型角形，聚集生长，体积较均匀，突起多（图 2B）。1 型细胞亚克隆培养未能产生子代，2 型细胞亚克隆培养，产生的子代克隆出现了长梭形和多角形两型细胞。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R739.65

【参考文献】